7 класс

7 класс немецкий язык и л бим л: ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс: Бим И.Л. Решебник

Содержание

ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс: Бим И.Л. Решебник

Что делать, чтобы сохранить успеваемость?

Школьные годы у всех разные: для кого-то они являются лучшим этапом в жизни, а кому-то даже больно о них вспоминать. Многие говорят о том, что отметки не важны и они не говорят о том, насколько умен человек, но по ним и будут судить, когда будут принимать в университет. Можно отметить, что восприятие школьников с разными цифрами в дневнике разительно отличается. Поэтому для построения своего успешного будущего стоит пользоваться ГДЗ по немецкому языку 7 класс И.Л. Бим.

Так, обладатели пятерок и четверок — это почти всегда любимчики учителей, которым сходят с рук некоторые пропущенные уроки и даже проверочные работы. Кроме того, они обладают дисциплинированностью, терпением, целеустремленностью и сдержанностью.

Чтобы точно понять, почему успеваемость важна, стоит просто обратиться к статистике, которая говорит, что именно отличники набирают максимальные баллы на ЕГЭ и поступают в самые престижные вузы страны. Позже они получают высокооплачиваемую работу, а кто-то даже открывает собственный бизнес.

Как добиться высот и преодолеть трудности с ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс, Бим И.Л.

Конечно, чтобы достигнуть такой планки, необходимо стараться. Нужно выработать в себе ответственность и пунктуальность, посещая каждый урок без опозданий и пропусков. Желательно выполнять все, даже самые сложные упражнения — это позволит освоить всю рабочую программу. А самой важной составляющей является устранение возникающих пробелов. Так, одним из наиболее проблемных предметов у многих является немецкий язык. Он сложен, но практически никто не выбирает его при сдаче ЕГЭ. Поэтому идеальным путем в этом случае станет открытие решебника. ГДЗ — это специальное пособие, придуманное для облегчения жизни учеников. В нем есть:

  • верные ответы на любой номер;


  • решения заданий, которые расписаны подробно и четко — это позволяет анализировать их и учить наизусть;


  • есть здесь и ответы на контрольные работы.


Найти такой, в том числе и сборник по немецкому языку для 7 класса от Бим ФГОС можно у нас онлайн. Это портативный и доступный формат, который отличается от бумажного — такой решебник возможно незаметно достать в любой ситуации и учитель его ре заметит.

ГДЗ по немецкому языку 7 класс Бим, Садомова

Авторы: И.Л. Бим, Л.В. Садомова.

В современном мире почти каждый может себе позволить посещать новые места и знакомиться с представителями незнакомых культур, владение языками стало необходимостью. Одним из основных языков для изучения является немецкий. Не стоит пугаться объёмных речевых конструкций, ведь здесь вы найдете лучшего помощника каждого школьника — ГДЗ по немецкому языку за 7 класс Учебник Бим.

Почему стоит выбрать именно немецкий для освоения:

  • научное развитие, официально второй используемый язык в науке на земном шаре, Германия вносит огромный вклад в исследования, подавляющее большинство международных выставок проводятся именно в Германии;

  • работа за границей, денежный заработок, выпускникам страна часто даёт работу за достойную заработную плату, многие работают официантами, барменами, горничными и так далее, ведь зарплата этих должностей в Европе выше, чем в России;

  • не секрет, что за рубежом постоянно проходят крупнейшие распродажи, знание языка даст возможность поторговаться с продавцом, ощущать себя в своей тарелке на различных ярмарках;

  • облегчит изучение английского языка, английский и немецкий принадлежат к одной западногерманской языковой группе, имеют множество похожих слов и оборотов.

Что представляет из себя онлайн-помощник по немецкому языку за 7 класс Учебник Бим

Сборник чётко структурирован, разделён на главы, каждая из которых состоит из блоков, представляющих собой отдельные структурные единицы, нацеленные на реализацию нужных видов учебной и разговорной дисциплин. Содержит немецко-русский словарь, грамматические таблицы и развёрнутое содержание.

На первый взгляд абитуриенту в 7 классе может показаться, что сам он не в состоянии справиться со столь сложным направлением. Спешим успокоить — вам поможет наш решебник для этого учебника.

Любой ученик может пропустить важное на уроке. Необязательно в этом вина учащегося, можно прослушать слова педагога, отсутствовать по уважительной причине. Восполнить пробелы поможет пособие по немецкому языку за 7 класс Бим. Также данным сборник будет полезен сами учителям для выстраивания грамотного плана урока, оценки способностей подопечных и самопроверки.

ГДЗ по немецкому языку для 7 класса на 5.fun

ГДЗ по немецкому языку для 7 класса на 5.fun

    • Немецкий язык 7 класс

    • Авторы:
      И.Л. Бим, Л.В. Садомова

    • Издательство:

      Просвещение 2015

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь

    • Авторы:
      И.Л. Бим, Л.В. Садомова, Л.М. Фомичева, Ж.Я. Крылова

    • Издательство:

      Просвещение 2016

    • Немецкий язык 7 класс
      Horizonte

    • Авторы:
      Аверин М.М., Джин Ф., Рорман Л.

    • Издательство:

      Просвещение 2016

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь Horizonte

    • Авторы:
      М. М. Аверин, Ф. Джин, Л. Роман, М. Збранкова

    • Издательство:

      Просвещение

    • Немецкий язык 7 класс
      Mosaik

    • Авторы:
      Гальскова Н.Д., Борисова Е., Шорихина И.

    • Издательство:

      Просвещение 2017

    • Немецкий язык 7 класс
      Книга для чтения

    • Авторы:
      Бим И.Л., Игнатова Е.В.

    • Издательство:

      Просвещение 2017

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь Mosaik

    • Авторы:
      Борисова Е.М., Шорихина И.Р.

    • Издательство:

      Просвещение 2016

    • Немецкий язык 7 класс
      Brucken

    • Авторы:
      Бим И.Л., Садомова Л.В., Спичко Н.А.

    • Издательство:

      Дрофа 2015

    • Немецкий язык 7 класс
      Контрольные задания Horizonte

    • Авторы:
      Аверин М.М., Гуцалюк Е.Ю., Харченко Е.Р.

    • Издательство:

      Просвещение 2017

    • Немецкий язык 7 класс
      Wunderkinder

    • Авторы:
      Радченко О.А., Конго И.Ф., Хебелер Г.

    • Издательство:

      Просвещение 2016

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь Wunderkinder

    • Авторы:
      Радченко О.А., Глушак В.М.

    • Издательство:

      Просвещение 2017

    • Немецкий язык 7 класс

    • Авторы:
      Будько А. Ф., Урбанович И. Ю.

    • Издательство:

      Высшая школа 2016

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь Alles Klar!

    • Авторы:
      Радченко О.А., Хебелер Г.

    • Издательство:

      Дрофа 2017

    • Немецкий язык 7 класс
      Alles Klar!

    • Авторы:
      Радченко О.А., Хебелер Г.

    • Издательство:

      Дрофа 2017

    • Немецкий язык 7 класс
      Сборник упражнений Horizonte

    • Авторы:
      Лытаева М.А., Базина Н.В.

    • Издательство:

      Просвещение 2019

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь Brucken

    • Авторы:
      Бим И.Л., Садомова Л.В., Спичко Н.А.

    • Издательство:

      Дрофа 2016

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь

    • Авторы:
      Будько А.Ф., Урбанович И.Ю.

    • Издательство:

      Аверсэв 2017

    • Немецкий язык 7 класс
      Контрольные задания

    • Авторы:
      Семенцова Е.А., Резниченко Н.А.

    • Издательство:

      Просвещение 2019

Часто ищут

    • Немецкий язык 7 класс
      Рабочая тетрадь

    • Авторы:
      И.Л. Бим, Л.В. Садомова, Л.М. Фомичева, Ж.Я. Крылова

    • Издательство:

      Просвещение 2016

    • История 7 класс

    • Авторы:
      А. Я. Юдовская, П. А. Баранов, Л. М. Ванюшкина

    • Издательство:

      Просвещение 2014

    • Физика 7 класс

    • Авторы:
      С.В. Громов, Н.А. Родина

    • Издательство:

      Просвещение 2015

    • Алгебра 7 класс

    • Авторы:
      Г. К. Муравин, К. С. Муравин, О. В. Муравина

    • Издательство:

      Дрофа 2016

    • Биология 7 класс
      Сфера жизни

    • Авторы:
      В.Б. Захаров, Н.И. Сонин

    • Издательство:

      Дрофа 2016

    • Алгебра 7 класс
      Задачник Базовый уровень

    • Автор:
      А.Г. Мордкович

    • Издательство:

      Мнемозина 2015

    • Химия 7 класс
      Рабочая тетрадь

    • Авторы:
      О.С. Габриелян, Г.А. Шипарева

    • Издательство:

      Дрофа 2015

    • Английский язык 7 класс
      Новый курс

    • Авторы:
      О.В. Афанасьева, И.В. Михеева

    • Издательство:

      Дрофа 2015

    • Английский язык 7 класс
      Углубленный уровень

    • Авторы:
      О.В. Афанасьева, И.В. Михеева

    • Издательство:

      Просвещение 2015

Учебник Немецкий язык 7 класс И.Л. Бим, Л.В. Садомова 2011

Хорошие знания и легкое решения заданий

Достигать высокого уровня успеваемости по немецкому готов помочь качественный учебник И.Л. Бима. Эта учебная книга за седьмой класс станет верным напарником для ребят и предоставит полную информацию по дисциплине, важную для ее закрепления. С данным справочником подростки легко усвоят новые материалы и смогут использовать их в практических целях в дальнейшем. Это приведет к учебе на 5+ и станет главной мотивацией в последующем обучении. Будьте на высоте, с профессиональной учебной книгой на Вклассе!

Выполняем любые задания на ура

Школьники должны изучать огромные объемы информации по дисциплине. Чтобы с этим не было никаких проблем, они пользуются учебными справочниками. Лучшим из них считается учебник по немецкому языку 7 класс (Бим, Садомова). Он приносит просто поразительное количество плюсов в жизнь ребят. Так, с ним чрезвычайно легко усваивать новые материалы и запоминать их. Это приводит к высокому показателю успеваемости, который сыграет важную роль в будущей учебе школьников и станет главным фундаментом для развития их уверенности в собственных силах.

ВКлассе – лучшее поле для учебы

Наш портал Vklasse уже прославился тем, что предлагает только профессиональные материалы для учебы, а также комфортное онлайн сотрудничество с ними. Мы действительно очень тщательно проверяем каждое пособие на своих страницах и стараемся обеспечить к нему открытый доступ. Учебник за 2011 год по немецкому был написан настоящими профессионалами своей области и на нашем ресурсе является полностью бесплатным. Книгой каждый желающий может воспользоваться при первой же необходимости, не прилагая дополнительных усилий.

Элементы учебной книги

Школьный учебник на ВКЛАССЕ целенаправленно разработан для того, чтобы подростки могли получать только качественные знания, которые обязательно станут полезными в будущем. Ребята найдут в книге много информации по немецкому языку с четко выраженными темами и правилами, которые актуальны для современной школьной программы. Они подкреплены рядом разных заданий и упражнений, которые помогают легко заполнить новые данные. Получайте отличные оценки с материалами, расположенными у нас на портале Vklasse!

И.Л. Бим, Л.В. Садомова, Н.А. Артемова.

Страница 1 из 20


ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: И.Л. Бим и И.Л. Бим, Л.В. Садомова, Н.А. Артемова.  
Книга для чтения / Сост. Е.В. Игнатова, Л. А. Чернявская — 4-е изд. — М.: Просвещение, 2002 г.

Lehrbuch (Учебник)
Nach den Sommerferien (Kleiner Wiederholungskurs)
После летних каникул (Небольшой курс повторения)

1.Мы снова встречаемся.

а) Как мы друг друга приветствуем?

б) Что спрашивают друг у друга вежливые люди?

Как дела? Как у вас дела?

с) Что отвечают вежливые люди?

Danke, gut. Danke, es geht. Und Ihnen?

Спасибо, хорошо. Спасибо, нормально. А у вас?

2.Мы разговариваем друг с другом/с учительницей, с учителем.
а) Мы интересуемся:

Wo warst du in den Ferien? — Где ты был на каникулах?

Wie war es dort? — Как там было?

Hast du viel Schönes erlebt? — Ты пережил много интересного? Wie hast du die Zeit verbracht? — Как ты прове л время?

Was gibt s sonst Neues, Interessantes? — Что есть еще нового и интересного?

Wo waren Sie im Sommer? — Где вы были летом?

Wie war es dort? — Как там было?

Haben Sie viel Schönes erlebt? — Вы пережили много интересного? Sind Sie mit den Ferien/mit dem Urlaub zufrieden? — Выдовольныканикулами/отпуском?

Wie hat Ihnen der Urlaub gefallen? — Каквампонравилсяотпуск?
б) Что отвечаем мы/что говорит учительница, учитель?

Ich war im Sommer auf dem Lande.

Es hat mir dort sehr gefallen.

Die Natur ist dort wunderschön.

Ich habe die Zeit sehr schön verbracht.

Ich habe die Ferien nützlich und sinnvoll verbracht.

Я был летом в деревне. Мне там очень понравилось.

Природа там прекрасна.

Я очень хорошо провел время.

Я с пользой и со смыслом провел каникулы.

3.Побеседуйте об этом друг с другом /с учительницей, с учителем.

4.а) Мы коротко сообщаем о наших летних каникулах. Каждый говорит, где он/она были и объясняет, почему ему/ей там понрави­лось/не понравилось.

Ich war am Schwarzen Meer.

Dort war es schön, denn es war warm.

Meine Sommerferien habe ich im Ferienlager verbracht.

Es hat mir dort sehr gefallen, denn wir haben dort viel Interessantes gemacht.

In den Sommerferien war ich zu Hause.

Es war dort schön, denn ich habe ein bißchen Geld verdient.

Я был на Черном море.

Там было здорово, потому что было тепло.

Мои летние каникулы я провел в лагере отдыха.

Мне там очень понравилось, потому что мы там делали много интересных вещей.

На летних каникулах я был дома.

Это было здорово, так как я заработал немного денег.
б) Мы рассказываем.

1. Wie schön ist doch der Sommer!

In den Sommerferien lebte ich auf dem Lande.

Dort war es sehr schön.

Jeden Tag badete ich im Fluß.

Ich ging auch oft in den Klub, um dort viele interessante Menschen kennenzulernen.

Ich lernte dort ein schönes Mädchen kennen.

Es war sehr hübsch.

Wir gingen oft in Disco.

Oft gingen wir einfach spazieren.

Es war sehr schön, auf dem Lande die Ferien zu verbringen.
2.Am liebsten verbringe ich die Sommerferien am Schwarzen Meer. In diesem Jahr war ich auch dort.

Dort war es sehr schön, denn es war warm.

Ich finde es toll, die Sommerferien am Meer zu verbringen.

1.Как все же здорово летом!

На летних каникулах я жил за городом.

Там было здорово.

Каждый день я купался в речке.
     Также я часто ходил в клуб, чтобы там познакомится с интерес­ными людьми.
     Там я познакомился с красивой девочкой.
     Она была очень привлекательной.
     Мы часто ходили на дискотеки.
     Часто мы просто ходили гулять.
    Это было здорово, провести каникулы за городом.
    2.Больше всего я люблю проводить летние каникулы на Черном море.
      В этом году я тоже там был.
     Там было здорово, так как было тепло.
      Я считаю, это здорово, проводить летние каникулы на море.

5.Вот отрывок из письма. Автор пишет своей подруге из Швей­царии, как он провел летние каникулы. Прочитайте письмо и от­ветьте на вопрос, кто автор — мальчик или девочка. Почему?
     Автобус привез нас в лагерь отдыха. Как же здесь красиво! Па­латки стоят в лесу. Недалеко есть речка. А за ней — поля, поля, зо­лотые поля.
      В первый день я познакомился с некоторыми мальчиками и де­вочками. Особенно мне понравилась Эльке из третьей палатки и Бернд из моей палатки.
       На второй день я познакомился еще со многими мальчиками и девочками. Мы пошли гулять в лес и купались в речке. Это было очень весело.
     На третий день учитель физкультуры рассказал нам о путешествии в горы. Но мы должны хорошо подготовиться к этому путешествию.
        Мой рюкзак был очень тяжелым, но Бернд помог мне.
     Ответ на вопрос: Der Autor ist ein Junge, weil er schreibt, daß Bernd aus seinem Zelt war. Jungen und Mädchen leben nicht in einem Zelt.
      Автор — мальчик, так как он пишет, что Бернд из его палатки. Мальчики и девочки не живут в одной палатке.

6.Чтобы лучше уметь читать, мы должны хорошо ориентироваться в тексте.
b) Просмотрите еще раз письмо (упр. 5) и прочитайте вслух в каждом предложении подлежащее и сказуемое.
c) Но где же подлежащее, а где сказуемое? Обратите внимание!

7.Вы хотите знать, как ваши сверстники из Германии, Австрии и из Швейцарии провели свои каникулы? Вот несколько писем.
a) Мы       читаем с помощью словаря.

Нюрнберг, 30.08

Дорогие друзья, Тези и Себастьян!

Мы долго друг другу не писали. Как у вас дела? Я на каникулах много путешествовала. Вначале я провела три недели в спортивном лагере. Потом я поехала к своим родственникам в Тюрингию. Два дня я жила у них в Веймаре, потом мы много путешествовали по Тюрингскому лесу. Тюрингския лес — гористая местность. Горы и лес. Что может быть красивее? …

Приветы от моих родителей и от меня.

Ваша Сандра.

Айзенштадт, 18.09.

Привет, дружище!

Снова школа, да? Такая досада! …
      На летних каникулах я мало отдыхал. Я хотел купить себе новые роликовые коньки и новый плейер и поэтому был вынужден работать. Вместе с двумя своими одноклассниками я работал на почте: мы сортировали письма и разносили почту. Это не было тяжело и даже доставляло удовольствие. Но больше всего удовольствия мне доставляют теперь мои новые роликовые коньки и маленький плейер.
     Как твои дела?
     Напиши как можно скорее
                                                                                                                         Твой Маттиас Берн, 20.09

Привет, Сандра!

В этом году у меня были очень <<красочные>> каникулы: две недели с родителями в Италии на море, неделя визит к тете в Нойзидлерзее в Австрии и остальное время дома. У меня, кстати, был гость из России — моя подруга по переписке Наташа. Мне она понравилась, и мне доставило удовольствие показать ей свой родной город и помочь ей немного улучшить ее немецкий. Она еще, к сожалению, не может свободно говорить по-немецки, но мы уже хорошо друг друга понимаем, а ее немецкий постоянно совершенствуется.

Надеюсь, что ты мне скоро напишешь и расскажешь о своих летних каникулах.

                                                             Твоя Хайди.


b) Мы смотрим на картинки и ищем авторов писем. Итак, кто же где?
     Auf dem ersten Bild sehen wir Matthias.
     Auf dem zweiten Bild sehen wir Heidi.
     Auf dem dritten Bild sehen wir Sandra.
c)  Кому кто написал?
     Matthias hat an Servns geschrieben.
      Heidi hat an Sandra geschrieben.
      Sandra hat an Thesi und Sebastian geschrieben.
d) Скажите двумя-тремя словами, как эти дети провели свои каникулы. Где они были летом?
      Matthias hat auf dem Postamt gearbeitet.
      Heidi war am Meer, bei der Tante und die übrige Zeit — zu Hause mit ihrer Brieffreundin aus Rußland.
      Sandra war im Sportlager und in Thüringen.

8. Просмотрите еще раз письма и найдите предложения с глаголами:
a) в презенсе    b) в перфекте    c) в претеритуме

9.Теперь мы пишем письма или краткие дневниковые записи о летних каникулах. Вы можеет также фантазировать.
      In den Sommerferien war ich in einem Ferienlager.
      Am ersten Tag habe ich viele Jungen und Mädchen kennengelernt. 
      Am zweiten Tag haben wir alle im Fluß gebadet.
      Am dritten Tag haben wir eine Wanderung gemacht.
      Am vierten Tag hatten wir einen Laufenwettkampf.
      Es war sehr lustig, die Ferien im Ferienlager mit den anderen Kindern zu verbringen.

На летних каникулах я был в лагере отдыха.

В первый день я познакомился со многими мальчиками и девочками.

Во второй день мы все купались в речке.

На третий день мы совершили пешую прогулку.

На четвертый день у нас было состязание в беге.

Было очень весело, проводить летние каникулы в лагере отдыха с другими детьми.

*10. Мы можем сделать интервью и спрашивать друг друга.

*11. Вы теперь знаете, кто где был летом. Приготовьте рассказы —  загадки о ваших одноклассниках. Но не называйте их имена. Группа должна угадать.
         О ком идет речь?

12. Хайди с Наташей много говорили и читали по-немецки. А вы? Вы не все позабыли? Давайте повторим!
a)   Что мы всего разного можем сказать о школе?
      Wo liegt sie? — Где она находится?
      Wie ist sie? — Какая она?
      Wie kann sie sein? — Какой она может быть?
      Was nehmen die Kinder in die Schule mit? — Что дети берут с собой в школу?
      Welchen Stundenplan wünschen sich einige Kinder? — Какое расписание желают себе некоторые дети?
      Welche Schulfächer hat die 6. Klasse? — Какие предметы есть в шестом классе?
      Welche Räume gibt es hier? — Какие комнаты здесь есть?
      Wo liegen diese Räume? — Где находятся эти комнаты?
b)   Что мы можем рассказать о временах года?
      Die Herbst: Es regnet oft.
      Der neue Schuljahr beginnt.
      Die Blätter fallen auf die Erde.
      Die Blätter sind bunt.
      Der Sommer: Die Schüler haben Ferien.
      Die Sonne scheint.
      Es ist warm.
      Alle Kinder baden im Fluß.
c)   Мы можем ответить на эти вопросы?
      Как ученики готовятся к коллективной поездке?
      Die Schüler studieren die Karte, suchen sich ein Reiseziel aus, packen die Koffer.
      Ученики изучают карту, выбирают цель путешествия, пакуют чемоданы.
      Что они берут с собой в коллективную поездку?
      Sie nehmen Kleidung, Schuhe, Koffer, Geld, Fahrkarten mit.
      Они берут с собой одежду, обувь, чемоданы, деньги, билеты.
      Что вы любите носить в путешествиях или во время коллективной поездки?
      Ich trage gern Jeans und T — Shirts.
      Я люблю носить джинсы и футболки.
      А что вы носите помимо этого?
      Sonst trage ich Pullover und Hosen.
      Помимо этого я ношу свитера и брюки.
      Вы можете описать внешность ваших друзей?
      Das ist mein Freund Wowa. Er trägt lange Haare. Er hat Jeans und ein T—Shirt an.
      Это мой друг Вова. У него длинные волосы. На нем надеты джинсы и футболка.

13. Что мы уже знаем о Германии?
a) Ответьте на вопросы. Возьмите в помощь группы слов справа и карту Европы (с. 14 учебника).
     Die Bundesrepublik Deutschland liegt in der Mitte Europas.
     Ihre Nachbarländer sind die Niederlande, Belgien, Luxemburg, Frankreich, die Schweiz, Österreich, die Tschechische Republik, Polen, Dänemark.
     Sie liegen neben der Bundesrepublik Deutschland.
     Österreich liegt an der Südgrenze der Bundesrepublik.
     Die Schweiz liegt auch an der Südgrenze der Bundesrepublik.
     Luxemburg liegt in der Mitte Europas.
     Liechtenstein liegt an der Südgrenze der Bundesrepublik.
     Belgien liegt im Westen.
b) Итак, где же лежат немецкоговорящие страны?
     Österreich liegt an der Südgrenze der Bundesrepublik.
     Die Schweiz liegt auch an der Südgrenze der Bundesrepublik.
     Luxemburg liegt in der Mitte Europas.
     Liechtenstein liegt an der Südgrenze der Bundesrepublik.
c) Закончите, пожалуйста, предожения.
     An der Westgrenze Deutschlands liegen seine westlichen Nachbarländer: die Niederlande, Belgien, Luxemburg und Frankreich.
     An der Südgrenze der BRD liegen die Schweiz, Liechtenstein und Österreich.
     Im Osten grenzt Deutschland an an Tschechische Republik und Polen.
     Im Norden grenzt Deutschland an Dänemark.

14. a) Прочитайте, пожалуйста, текст и скажите, что для вас но­во.

Где говорят по-немецки?

В шести государствах немецкий язык является государствен­ным языком: в Федеративной Республике Германия, в Австрии, в Лихтенштейне, в части Швейцарии, в части Люксембурга и в Бельгии.

Для ста миллионов людей немецкий — родной язык: в Федера­тивной Республике Германия, в Австрии, в Швейцарии, в Люксем­бурге, в Лихтенштейне, в Бельгии и во многих других странах, так­же и в некоторых уголках России.

Во всем мире многие люди учат немецкий язык. Немецкий язык — язык культуры и науки. Кто не знает великих немецких поэтов Гете и Шиллера? Во всех театрах мира ставятся их драмы, а также драмы современных писателей и поэтов, например, Бертольда Брех­та, Макса Фриша, Фридриха Дюренматта и других.
     Имена Рентгена и Дизеля вам тоже возможно знакомы, не прав­да ли? В каждой поликлинике сейчас стоят рентгеновские аппараты. Много локомотивов, кораблей и тракторах ездят на дизельных мо­торах.
     Немецкий был родным языком Александра и Вильгельма фон Гумбольдтов, Канта и Гегеля, Роберта Коха, Альберта Швайцера, Альберта Эйнштейна, Макса Планка, Фердинанда фон Цеппелина и многих других ученых и изобретателей.
b)  Итак, что мы узнали нового? Сколько немецкоговорящих стран в Европе? Какие?
    Wir haben viel neues über die deutsche Sprache erfahren. In Europa gibt es sechs deutschsprachige Länder: die Bundesrepublik Deutschland, Österreich, die Schweiz, Luxemburg, Liechtenstein und Belgien.

15. Вы считаете немецкий язык сложным или простым?
a) Мы читаем мнение одной немецкой поэтессы.

Спите хорошо!

Я, ты, он, она, оно,
немецкий язык — это стресс.

Вам и ваш, мы и вы,
И зачем же я здесь сижу?

Нам и наш, твой и мой,

Перестану лучше заниматься.

Лягу, закрою глаза —
Спокойного отдыха!

b) А что вы думаете по этому поводу?
        Ich meine, die Deutsche Sprache ist nicht so schwer wie die deutsche Dichterin meint. Und dazu noch interessant!
        Я считаю, что немецкий язык не такой трудный, как считает не­мецкая поэтесса. Да к тому же еще и интересный!

16. a) Как вы думаете, почему мы начали нашу работу после ка­никул с небольшого курса повторения?
       Чтобы поговорить о летних каникулах? Чтобы кое-что вспом­нить про Германию? Чтобы вспомнить грамматику? Чтобы повто­рить лексику? И, может быть, для того, чтобы при этом узнать что- то новое?
b) Да, все верно. Это удалось? Ja, es hat geklappt!
c) Кто хочет еще кое-что повторить? Что? Нам в этом может по­мочь рабочая тетрадь?

Лексика

der Norden — север

der Westen — запад

der Osten — восток

der Süden — юг

die Grenze — граница

sich erholen — отдыхать

der Klassenkamerad — одноклассник

Servus! — Привет! (австр.)

17. А теперь прочитаем кое-что о нашем новом учебнике при помощи словаря.

Как называется наш новый учебник? Что же тут нового?

Учебник ведет нас не только в Германию, но и в Австрию и в Швейцарию.

При этом мы немного знакомимся с этими странами. Может быть, мы уже что-то о них знаем?

Мы «встречаем» в учебнике не толькл немецких, но и австрий­ских и швейцарских детей.

Мы мысленно посещаем некоторые немецкие, австрийские и швейцарские города и учимся там ориентироваться.

Мы будем больше работать самостоятельно. И рабочая тетрадь поможет нам в этом!

Мы много читаем и знакомимся со многими немецкими авто­рами — представителями классической немецкой литературы и с современными авторами. И книга для чтения нам при этом помо­жет!

Но речь будет идти также и о нас самих, о нашей стране, о на­шей жизни, так как мы стремимся к диалогу с другими народами, с другими культурами.
     Итак, мы целеустремленно становимся на этот путь!

Календарно-тематическое планирование по немецкому языку 7 класс ФГОС ООО к УМК Бим И.Л. | Календарно-тематическое планирование по немецкому языку (7 класс) на тему:

№

п/п урока

Наименование раздела и тем

Часы учебного времени

Сроки прохождения

Основные виды учебной деятельности (УУД)

Реализация электронного обучения

план

факт

Предметные

Личностные

Метапредметные

ПОСЛЕ ЛЕТНИХ КАНИКУЛ (Повторение)

5

http://belclass.net/

1

Летние каникулы прошли! Повторение лексических единиц.

1

04.09

Повторить лексику по подтемам «Лето, школа, каникулы»

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

2

Как провели каникулы немецкие школьники. Развитие навыков монологической речи.

1

05.09

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

3

Письма из Германии.

Развитие навыков чтения.

1

07.09

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

4

Делимся впечатлениями о каникулах. Развитие навыков монологической речи.

1

11.09

Применение правил изученных ранее

Развитие трудолюбия, целеустремленности

Развитие исследовательских  учебных действий, включая навыки работы с информацией

5

Где говорят по — немецки? Работа с картой.

1

12.09

Оперирование правилом в немецком языке

Развитие воли,

креативности

Формирование умений использовать грамматическое правило

I ЧТО НАЗЫВАЕМ МЫ НАШЕЙ РОДИНОЙ?

15

6

Что такое Родина для каждого из нас? Введение ЛЕ по теме.

1

14.09

Владение элементарными средствами чувств и эмоций на немецком языке

Развитие умений перевоплощения,

инсценирования

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

7

Мнения немецких школьников о Родине. Развитие навыков чтения.

1

18.09

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Формирование личностной коммуникативной рефлексии

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

8

Малая Родина. Обучение чтению с извлечением  полной информации. Входной контроль

1

19.09

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

9

Что относится к понятию «Родина»? Активизация употребления ЛЕ по теме.

1

21.09

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

Толерантное отношение к проявлению иной культуры

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

10

Что Родина для тебя? Обучение монологической речи по теме.

1

25.09

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Формирование умения воспринимать текст как единое смысловое целое и выделять основную мысль, смысловое ядро текста

11

Австрия – идеальная страна для туризма. Обучение чтению с извлечением основной информации.

1

26.09

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

Стремление к познанию  нового

Освоение правил и навыков ведения беседы

12

Швейцария – настоящая страна мозаики. Работа над текстами.

1

28.09

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Толерантное отношение к проявлению иной культуры

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

13

Европа как общий дом для людей. Формирование лексических навыков говорения.

1

02.10

Сообщать краткие сведения о прочитанном

Создание определенной эмоциональной настроенности через восприятие романтической атмосферы немецкого города

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

14

Общая Европа – что это?

Природа нашей страны.

1

03.10

Владение элементарными средствами чувств и эмоций на немецком языке

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодейство-вать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

15

Письмо из Гамбурга. Развитие навыков аудирования.

1

05.10

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение правил и навыков ведения беседы

16

Письмо из Брнмена. Работа над текстами.

1

09.10

Употребление нового правила в немецком языке

Развитие мышления, памяти

Развитие исследовательских  учебных действий, включая навыки работы с информацией

17

Грамматика. Инфинитивный оборот.

1

10.10

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Осуществлять регулятивные действия самоконтроля в процессе коммуникативной деятельности

18

Грамматика. Изменение прилагательного.

1

12.10

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

Формирование общекультурной и этнической идентичности

Формирование умения воспринимать текст как единое смысловое целое и выделять основную мысль, смысловое ядро текста

19

Моя родина – Силезия. Формирование лексических навыков письма.

1

16.10

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение правил и навыков ведения беседы

20

Страноведение. Швейцария.

1

17.10

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

Стремление к познанию  нового

Освоение правил и навыков ведения беседы

III. ЛИЦО ГОРОДА — ВИЗИТНАЯ КАРТОЧКА СТРАНЫ

15

21

Город, каким он может быть? Работа над стихотворением.

1

19.10

Воспринимать на слух речь учителя и одноклассников. Уметь вести беседу по предложенной ситуации

Формирование интереса  к образу жизни, быту другого народа

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

22

Старые немецкие города: Лейпциг, Нюрнберг. Контроль письма.

1

23.10

Сообщать краткие сведения о прочитанном

Привлечение внимания к миру профессий, к разнообразию человеческих интересов

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

23

Города Германии: Дрезден, Веймар. Контроль аудирования.

1

24.10

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Развитие наблюдательности. Умение сопоставлять, сравнивать предметы

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

24

Вена – столица Австрии. Контроль говорения.

1

26.10

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

Формирование толерантного отношения к окружающему миру

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

25

Берн – средневековый город. Контроль чтения.

1

27.10

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

26

Особенности старых немецких городов. Формирование лексических навыков чтения.

1

08.11

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

27

Из истории Москвы. Чтение текста с полным пониманием прочитанного.

1

09.11

Формирование мотивации изучения немецкого языка

28

Москва – город театров и музеев. Чтение текста с извлечением информации.

1

13.11

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Осуществлять регулятивные действия самоконтроля в процессе коммуникативной деятельности

29

Города Золотого кольца. Развитие навыков аудирования.

1

14.11

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

Формирование общекультурной и этнической идентичности

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

30

Моё родное село. Урок закрепления и повторения.

1

16.11

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

31

История создания стихотворения Гёте «Горные вершины» Активизация употребления ЛЕ.

1

20.11

32

Картинная галерея в Берлине под открытым небом. Развитие навыков монологической речи.

1

21.11

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

33

Повторение. Немецкие города. Развитие навыков диалогической речи.

1

23.11

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Формирование умений задавать вопросы по ситуации

34

Обобщающее повторение. Москва – столица нашей Родины. Повторение грамматического материала

1

27.11

Сообщать краткие сведения о прочитанном

Формирование личностной коммуникативной рефлексии

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

35

Город, каким он может быть? Развитие навыков монологической речи по теме

1

28.11

Владение элементарными средствами чувств и эмоций на немецком языке

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Освоение правил и навыков ведения беседы

III ЖИЗНЬ В БОЛЬШОМ ГОРОДЕ. КАКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЗДЕСЬ ЕСТЬ?

15

36

Современные виды транспорта. Развитие навыков монологической речи.

1

30.11

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Формирование интереса к привычкам другого народа

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

37

Новая лексика по теме. Диалог.

1

04.12

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

38

Правила движения в городе. Формирование лексических навыков чтения и говорения.

1

05.12

Воспринимать на слух речь учителя и одноклассников. Уметь вести беседу по предложенной ситуации

Овладение коммуникативными умениями, необходимыми для правильной речевой и поведенческой реакции в ситуации

Формирование умений задавать вопросы по ситуации

39

Как ориентироваться в незнакомом городе? Активизация употребления ЛЕ по теме.

1

07.12

Владение элементарными средствами чувств и эмоций на немецком языке

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

40

Впервые в Берлине. Обучение диалогической речи.

1

11.12

Применение правил изученных ранее

Развитие мышления, памяти

Развитие исследовательских  учебных действий, включая навыки работы с информацией

41

О чем мечтают городские дети? Развитие навыков аудирования.

1

12.12

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

42

Первая молодежная улица Берлина. Активизация употребления ЛЕ по теме.

1

14.12

43

Дорога к школе. Обучение чтению. Промежуточный контроль

1

18.12

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

Формирование интереса к другой культуре

Формирование умений задавать вопросы по ситуации

44

Грамматика. Придаточные дополнительные предложения.

1

19.12

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

Формирование личностной коммуникативной рефлексии

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

45

Грамматика. Вспомогательные глаголы. Контроль чтения

1

21.12

Употребление нового правила в немецком языке

Развитие мышления, памяти, целеустремленности

Формирование умений использовать грамматическое правило

46

План-схема города. Контроль письма.

1

22.12

Воспринимать на слух речь учителя и одноклассников. Уметь вести беседу по предложенной ситуации

Развитие коммуникативной компетенции, креативности

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

47

Из истории автомобиля. Контроль аудирования.

1

25.12

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Овладение коммуникативными умениями, необходимыми для правильной речевой и поведенческой реакции в ситуации

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

48

Дорожные знаки. Контроль говорения.

1

26.12

Сообщать краткие сведения о прочитанном

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение правил и навыков ведения беседы

49

Автобаны в Германии. Развитие навыков монологической речи.

1

10.01

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

Привлечение внимания к экологическим проблемам города

Формирование умения воспринимать текст как единое смысловое целое и выделять основную мысль, смысловое ядро текста

50

Страноведение. Метрополитен в Берлине.

1

11.01

Владение элементарными средствами чувств и эмоций на немецком языке

Развитие культуры общения

Формирование умений задавать вопросы по ситуации

IV.В ДЕРЕВНЕ ЕСТЬ МНОГО ИНТЕРЕСНОГО

15

51

Я мечтаю о деревне. Выразительное чтение стихотворения.

1

15.01

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Осуществлять регулятивные действия самоконтроля в процессе коммуникативной деятельности

52

Домашние животные и птицы. Введение ЛЕ по теме

1

16.01

Воспринимать на слух небольшой текст.

Выбирать правильный ответ, соответствующий содержанию прослушанного.

Описывать дома разного вида и назначения.

Комментироватьплангорода.

формирование готовности и

способности вести диалог

Овладение коммуникативными умениями, необходимыми для правильной речевой и поведенческой реакции в ситуации

53

Работа в деревне. Лексика по теме.

1

18.01

Различать типичные немецкие дома, называть их.

Называть некоторые архитектурные достопримечательности немецких городов

формирование готовности и

способности вести диалог

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

54

Все под одной крышей. Чтение текста.

1

22.01

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

55

Прекрасная жизнь в деревне. Активизация употребления лексики.

1

23.01

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

56

Посещение конюшни. Чтение текста с полным пониманием прочитанного.

1

25.01

Сообщать краткие сведения о прочитанном

Развитие внимания, памяти

Формирование умения воспринимать текст как единое смысловое целое и выделять основную мысль, смысловое ядро текста

57

Жизнь в деревне: преимущества и недостатки. Формирование лексических навыков говорения.

1

29.01

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

Знакомство с формулами речевого этикета

Освоение правил и навыков ведения беседы

58

Жизнь в русской деревне. Формирование лексических навыков аудирования  

1

30.01

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими, выполняя разные социальные роли

59

Русские народные промыслы. Чтение текста с излечением  информации.

1

01.02

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

Привлечение внимания учащихся к проблемам экологии жилища

Формирование умений задавать вопросы по ситуации

60

Знаменитые русские деревни. Обучение чтению.

1

05.02

Рассказывать  о своем доме

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Осуществлять регулятивные действия самоконтроля в процессе коммуникативной деятельности

61

Грамматика. Форма будущего времени  Futur I .

1

06.02

Сообщать краткие сведения о прочитанном

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

62

Грамматика. Сложноподчиненные предложения.

1

08.02

Описывать рисунки с изображением различных комнат, используя новую лексику.

формирование готовности и способности вести диалог

Знакомство с формуламиречевогоэтикета

63

Современные деревни. Обучение высказыванию с опорой на прочитанное.

1

12.02

Рассказывать о своей комнате.

Употреблять в речи существительные в Dativ после глагола helfen

формирование готовности и способности вести диалог

Привлечение внимания учащихся к проблемам экологии жилища

64

Праздник урожая в Германии. Развитие навыков аудирования.

1

13.02

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

Повторить лексику по подтемам «Погода, времена года»

65

Страноведение. Поэт Рольф Кренцер.

1

15.02

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

V. ПРОБЛЕМА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

17

66

Наша планета в опасности.Введение новой лексики по теме.

1

19.02

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

67

Что может привести планету к катастрофе? Чтение текста с полным пониманием прочитанного.

1

20.02

Развитие трудолюбия, целеустремленности

Развитие исследовательских  учебных действий, включая навыки работы с информацией

Применение правил изученных ранее

Привлечение внимания к природе

68

Как может человек спасти планету? Развитие навыков монологической речи.

1

22.02

Развитие воли,

Креативности

Привлечение внимания к обычаям другого народа

Формирование умений работы с текстом

Оперирование правилом в немецком языке

69

Озоновая дыра. Чтение текста с извлечением информации.

1

26.02

Толерантное отношение к проявлению иной культуры

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных ком.типов

70

Загрязнение воды. Активизация употребления ЛЕ.

1

27.02

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

Развивать письменную речь с опорой на образец

71

Мусор в Германии. Развитие навыков чтения.

1

01.03

Расспрашивать своего речевого партнёра о временах года в городе.Воспринимать диалог в аудиозаписи.Читать в группах диалог вместе с ликтором.

Разыгрывать диалоги в группах.

формирование готовности и способности вести диалог

Развитиеуменийперевоплощения,

инсценирования

72

Нефть а море. Чтение текста с излечением  информации.

1

05.03

Информация о рождественскомбазаре и рождественской пирамиде,о проведении карнавала в Германии,праздновании Пасхи и о поделках,которые могут мастерить дети в качестве подарков к праздникам

формирование готовности и способности вести диалог

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

73

Проект «Планета в опасности». Формирование лексических навыков письма.

1

06.03

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Формирование умения воспринимать текст как единое смысловое целое и выделять основную мысль, смысловое ядро текста

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

74

Мы рассказываем о загрязнении природы. Обучение монологическому высказыванию по теме.

1

12.03

Стремление к познанию  нового

Освоение правил и навыков ведения беседы

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

75

Грамматика. Виды предложений в немецком языке.

1

13.03

Толерантное отношение к проявлению иной культуры

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

76

Немецкие сверстники о защите природы. Чтение текста с полным пониманием прочитанного.

1

14.03

Создание определенной эмоциональной настроенности через восприятие романтической атмосферы немецкого города

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

Сообщать краткие сведения о прочитанном

77

Чем полезны пчелы? Контроль  чтения

1

15.03

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

Владение элементарными средствами чувств и эмоций на немецком языке

78

Национальный парк в Австрии. Контроль письма

1

19.03

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение правил и навыков ведения беседы

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы сво

79

Юные защитники природы. Контроль аудирования.

1

20.03

Развитие мышления, памяти

Развитие исследовательских  учебных действий, включая навыки работы с информацией

Употребление нового правила в немецком языке

80

Молодежные экологические движения. Контроль говорения.

1

22.03

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Осуществлять регулятивные действия самоконтроля в процессе коммуникативной деятельности

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

81

Повторение «Экологические проблемы». Формирование лексических навыков говорения.

1

02.04

Формирование общекультурной и этнической идентичности

Формирование умения воспринимать текст как единое смысловое целое и выделять основную мысль, смысловое ядро текста

Умение находить ошибки, анализировать и исправлять их Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

82

Страноведение. Энергия ветра.

1

03.04

Разучить рифмовку, осмысливая её содержание и обращая внимание на произношение.

Употреблять в речи степени сравнения прилагательных, включая исключения из правил.

формирование готовности и способности вести диалог

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Vl. В ЗДОРОВОМ ТЕЛЕ — ЗДОРОВЫЙ ДУХ

20

83

Спорт и здоровье. Лексика по теме.

1

05.04

Читать пожелания немецких детей о будущих профессиях и комментировать их высказывания

формирование готовности и способности вести диалог

Развитие мышления, памяти

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

84

Значение спорта в жизни человека. Активизация употребления лексики.

1

09.04

Стремление к лучшему осознанию культуры своего народа

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

Воспринимать на слух речь учителя и одноклассников. Уметь вести беседу по предложенной ситуации

85

Спорт и здоровье человека. Развитие навыков диалогической речи.

1

10.04

Формирование интереса  к образу жизни, быту другого народа

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

Воспринимать на слух речь учителя и одноклассников. Уметь вести беседу по предложенной ситуации

86

На приёме у школьного врача. Инсценирование диалога.

1

12.04

Привлечение внимания к миру профессий, к разнообразию человеческих интересов

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

Сообщать краткие сведения о прочитанном

87

Из истории спорта. Обучение чтению с полным пониманием прочитанного.

1

16.04

Развитие наблюдательности. Умение сопоставлять, сравнивать предметы

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

88

Олимпийские игры. Обучение чтению с извлечением информации.

1

17.04

Формирование толерантного отношения к окружающему миру

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

89

Роль спорта в формировании характера человека. Активизация использования в речи изученных лексических единиц.

1

19.04

Формирование коммуникативной компетенции в межкультурной коммуникации

Развитие коммуникативной компетенции. Включая умения взаимодействовать с окружающими,

выполняя разные социальные роли

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

90

Разное отношение к спорту. Развитие навыков монологической речи.

1

23.04

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

91

Мой любимый вид спорта. Обучение монологическому высказыванию по теме.

1

24.04

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Развитие смыслового чтения, включая умение определять тему по заголовку, выделять основную мысль

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

92

В здоровом теле – здоровый дух. Развитие навыков аудирования.

1

26.04

Формирование общекультурной и этнической идентичности

Осуществлять регулятивные действия самоконтроля в процессе коммуникативной деятельности

Читать аутентичные тексты, уметь оценивать полученную информацию, выражать свое мнение

93

Современные виды спорта. Обучение чтению с полным пониманием прочитанного.

1

30.04

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Усвоение приемов постановки вопросов к тексту и составления плана

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

94

Популярные виды спорта в Германии. Обучение высказыванию с опорой на прочитанное.

1

03.05

Совершенствовать технику чтения вслух, используя рифмовки.

Использовать в речи лексику по теме «Профессии», а также модальный глагол mögen в форме möchte

формирование готовности и способности вести диалог

Формирование мотивации изучения немецкого языка

95

Здоровое питание. Формирование лексических навыков говорения.

1

07.05

Страноведческая информация оденежной системе Германии. Рисункис изображением евро, а также изображения копилок для денег, которые используют немецкие дети

формирование готовности и способности вести диалог

Формирование общекультурной и этнической идентичности

96

Виды спорта. Развитие навыков чтения.

1

08.05

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

Готовность  и умение осуществлять индивидуальную проектную работу

97

Грамматика. Предлоги.

1

14.05

Формирование мотивации изучения немецкого языка

Формирование умений задавать вопросы по ситуации

Учить воспринимать на слух небольшие по объёму диалоги и воспроизводить их.

98

Грамматика. Образование слов в немецком языке. Контроль письма

1

15.05

Формирование личностной коммуникативной рефлексии

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

Сообщать краткие сведения о прочитанном

99

Скейтборд как новый вид спорта. Контроль аудирования

1

17.05

Формирование интереса к привычкам другого народа

Развитие умений планировать свое речевое и неречевое поведение в рамках темы

Учить расспрашивать собеседника и отвечать на его вопросы, высказывая свое мнение

100

Страноведение. Как появился футбол в разных странах. Контроль  чтения

1

21.05

Готовность содействовать ознакомлению с культурой другой страны

Освоение приемов логического запоминания информации, извлеченной из текста

Распознавание и употребление в устной и письменной речи основных норм речевого этикета, принятых  в стране изучаемого языка

101

Что нужно, чтобы быть здоровым? Контроль говорения.

1

22.05

Повторять материал

формирование готовности и способности вести диалог

Формирование интереса к другой культуре

102

Повторение. Итоговый контроль

1

24.05

Соблюдение ритмико-интонационных особенностей  предложений разных коммуникативных типов

Осознание возможностей самореализации средствами языка

Формировать навыки поиска и выделение нужной информации

▶▷▶ гдз по немецкому и.л. бим л.в.садомова за 7 класс

▶▷▶ гдз по немецкому и.л. бим л.в.садомова за 7 класс

ИнтерфейсРусский/Английский
Тип лицензияFree
Кол-во просмотров257
Кол-во загрузок132 раз
Обновление:09-12-2018

гдз по немецкому ил бим лвсадомова за 7 класс — Yahoo Search Results Yahoo Web Search Sign in Mail Go to Mail» data-nosubject=»[No Subject]» data-timestamp=’short’ Help Account Info Yahoo Home Settings Home News Mail Finance Tumblr Weather Sports Messenger Settings Want more to discover? Make Yahoo Your Home Page See breaking news more every time you open your browser Add it now No Thanks Yahoo Search query Web Images Video News Local Answers Shopping Recipes Sports Finance Dictionary More Anytime Past day Past week Past month Anytime Get beautiful photos on every new browser window Download ГДЗ по Немецкому языку 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова eurokime/gdz/nemeckiy_yazik/ 7 class/bim Cached Здесь вы найдете ГДЗ с подробным и полным решением упражнений (номеров) по Немецкому языку за 7 класс , автор: ИЛ Бим , ЛВ Садомова Издательство: Просвещение ФГОС ГДЗ (решебник) по немецкому языку 7 класс Бим Садомова gdzmaniacom/gdz/232-nemeckij-yazyk- 7 -klass-bim-sadomova Cached Перед вами готовые домашние задания с онлайн ответами к учебнику по немецкому языку за 7 класс автора ИЛ Бим , ЛВ Садомова ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс: Бим ИЛ Решебник gdzru/class- 7 /nemeckiy_yazik/bim Cached ГДЗ : Спиши готовые домашние задания по немецкому языку за 7 класс , решебник ИЛ Бим , ФГОС, онлайн ответы на gdzru Гдз По Немецкому Ил Бим Лвсадомова За 7 Класс — Image Results More Гдз По Немецкому Ил Бим Лвсадомова За 7 Класс images ГДЗ за 10 класс по Немецкому языку ИЛ Бим, ЛВ Садомова gdzim/10-klass/nemeckiy_yazik/bim Cached ГДЗ содержит верные и подробные ответы с несколькими вариантами решения по Немецкому языку за 10 класс , автор издания: ИЛ Бим , ЛВ Садомова , МА Лытаева С нами учебный процесс станет лучше! ГДЗ за 7 класс по Немецкому языку ИЛ Бим, ЛВ Садомова gdzim/ 7 -klass/nemeckiy_yazik/arbeitsbuch-bim Cached ГДЗ содержит верные и подробные ответы с несколькими вариантами решения по Немецкому языку за 7 класс , автор издания: ИЛ Бим , ЛВ Садомова , ЛМ Фомичева, ЖЯ Крылова рабочая тетрадь С нами ГДЗ по немецкому языку за 7 класс gdzmaniacom/gdz/class- 7 /nemeckiy_yazik- 7 Cached ГДЗ (решебник) по немецкому языку за 7 класс и онлайн ответы к домашним заданиям ГДЗ по немецкому языку за 10 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова gdzru/class-10/nemeckiy_yazik/bim Cached ГДЗ : Спиши готовые домашние задания по немецкому языку за 10 класс , решебник ИЛ Бим , ФГОС, онлайн ответы на gdzru Учебник Немецкий язык 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова 2011 vklasseonline › … › Немецкий язык Полный и качественный учебник Немецкий язык 7 класс ИЛ Бим , ЛВ Садомова 2011 скачать онлайн Доступно на ваших смартфонах ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: ИЛ Бим, ЛВ reshebnik5-11ru › … › ГДЗ 7 класс Главная ГДЗ 6 класс ГДЗ 7 класс Немецкий язык 7 класс ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: ИЛ Бим , ЛВ Садомова , НА Артемова ГДЗ по Немецкому языку 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова, ЛМ eurokime/gdz/nemeckiy_yazik/ 7 class/arbeitsbuch-bim Cached Приветствуем на образовательном портале Еуроки Здесь вы найдете ГДЗ с подробным и полным решением упражнений (номеров) по Немецкому языку рабочая тетрадь за 7 класс , автор: ИЛ Бим , ЛВ Садомова , ЛМ Фомичева, ЖЯ Promotional Results For You Free Download | Mozilla Firefox ® Web Browser wwwmozillaorg Download Firefox — the faster, smarter, easier way to browse the web and all of Yahoo 1 2 3 4 5 Next 4,460 results Settings Help Suggestions Privacy (Updated) Terms (Updated) Advertise About ads About this page Powered by Bing™

  • учащийся способны освоить немецкий язык самостоятельно
  • Л В Садомова 2 ГДЗ по Немецкому языку 7 класс И Л Бим
  • Садомова Л В издательства Просвещение Автор: Бим И Л

без помощи учителей и родителей Читать ещё ГДЗ по Немецкому языку 7 класс авторы: И Л Бим

Л В Садомова

  • автор: ИЛ Бим
  • автор: ИЛ Бим
  • ЛВ Садомова 2011 vklasseonline › … › Немецкий язык Полный и качественный учебник Немецкий язык 7 класс ИЛ Бим

гдз по немецкому ил бим лвсадомова за 7 класс — Все результаты ГДЗ учебник немецкий язык 7 класс ИЛ Бим › ГДЗ › 7 класс › Немецкий язык › Бим Похожие языку для учащихся 7 класса , авторов И Л Бим , Л В Садомова на 2016 учебный год ГДЗ к книге для чтения по немецкому языку за 7-9 класс Бим И ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс: Бим ИЛ Решебник — GDZru › ГДЗ › 7 класс › Немецкий язык › Бим ИЛ ГДЗ : Спиши готовые домашние задания по немецкому языку за 7 класс , Авторы : И Л Бим , Л В Садомова Немецкий язык 7 класс рабочая тетрадь ГДЗ по немецкому языку за 7 класс — GDZMANIACOM gdzmaniacom/gdz/class-7/nemeckiy_yazik-7/ ГДЗ по немецкому языку 7 класс авторы: И Л Бим , Л В Садомова О проекте · Правообладателям · Контакты GDZMANIACOM © 2018 По всем ГДЗ по немецкому языку для 7 класса ИЛ Бим Заходите, не пожалеете! Тут отличные гдз по немецкому языку для 7 класса , И Л Бим , Л В Садомова от Путина Очень удобный интерфейс с ГДЗ решебник по немецкому языку 7 класс Бим Садомова › Решебники › 7 класс › Немецкий язык ГДЗ по немецкому языку за 7 класс авторов Бим И Л , Садомовой Л В 2015 года издания В чётко структурированном пособии 6 основных разделов ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова ФГОС Убедись в правильности решения задачи вместе с ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс И Л Бим , Л В Садомова Ответы сделаны к книге 2015 года от ГДЗ по Немецкому языку 7 класс: Немецкий язык ИЛ Бим Похожие авторы: И Л Бим , Л В Садомова ГДЗ: Готовые домашние задания по Немецкому языку 7 класс , решебник Немецкий язык И Л Бим ГДЗ к рабочей ГДЗ по Немецкому языку 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова — Гдзрус ГДЗ к рабочей тетради 7 класс Бим можно найти здесь ГДЗ к книге для чтения по немецкому языку за 7-9 класс Бим И Л можно найти здесь Решебник по Немецкому языку за 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова Данное пособие содержит решебник ( ГДЗ ) по Немецкому языку за 7 класс Автора: И Л Бим , Л В Садомова Издательство: Просвещение Полные и ГДЗ по немецкому языку 7 класс Бим Садомова оранжевый учебник ГДЗ по немецкому языку 7 класс Бим , Садомова , оранжевый учебник содержит языку за 7 класс ГДЗ по немецкому языку Бим И Л 7 класс Бим И Л Тем современным семиклассникам, которые изучают немецкий язык в ГДЗ по Немецкому Языку 7 класс Бим Решения по Учебнику Поэтому, не стоит полагаться целиком только на решебник , а нужно заниматься так же и Перейти к учебнику Немецкий язык 7 класс ( Бим И Л ) Не найдено: садомова Решебник (ГДЗ) Немецкий язык, 7 класс (ИЛ Бим, ЛВ — DocBazaru Решебник ( ГДЗ ) для Немецкий язык, 7 класс (И Л Бим , Л В Садомова , HA Артемова) 2009 Решебник (ГДЗ) Немецкий язык, 7 класс (ИЛ Бим, ЛВ — DocBazaru Решебник ( ГДЗ ) для Немецкий язык, 7 класс (И Л Бим , Л В Садомова , НА Артемова) 2004 ГДЗ ИЛ Бим, ЛВ Садомова за 7 класс по Немецкому языку ФГОС ГДЗ и Решебник за 7 класс по Немецкому языку поможет Вам найти верный ответ на самый сложный номер задания онлайн Автор учебника: И Л Бим , Домашняя работа по немецкому языку К учебнику ИЛ Бим 7 › › 7 класс › Иностранные языки Купить Попов Михаил Александрович «Домашняя работа по немецкому языку Учебник немецкого языка для 7 класса общеобразовательных учреждений» / И Л Бим , Л В Садомова , Серия: Решебник Купить Попов Михаил Александрович «Домашняя работа по математике за 5 класс к учебнику Н «Домашняя работа по немецкому языку за 7 класс к учебнику языку за 7 класс к учебнику Немецкий язык 7 кл И Л Бим и др Максим Попов: В Рецензии и отзывы на книгу «Домашняя работа по немецкому языку за 7 Пособие из серии » Решебник » стоит покупать, в первую очередь , для 7 класса общеобразовательных учреждений» / И Л Бим , Л В Садомова , ГДЗ немецкий язык 7 класс — Reshebnik5-11ru reshebnik5-11ru › ГДЗ 7 класс Похожие МИР ГДЗ — это сборник готовых домашних заданий для учеников с 5 по 11 ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: И Л Бим , Л В Садомова , Немецкий язык 7 класс: поурочные планы по учебнику И Л Бим, Л › › Средняя школа › Предметы Рейтинг: 5 — ‎11 274 отзыва — ‎56,70 ₽ — ‎В наличии 7 класс : поурочные планы по учебнику И Л Бим , Л В Садомовой , Н А Артемовой » Немецкий язык Шаги 3″ — Лемякина О В, Учитель, можно купить по Deutsch: 7 klasse: Arbeitsbuch / Немецкий язык 7 класс Рабочая › › Федеральный перечень учебников 2018/2019 Похожие 7 класс Рабочая тетрадь от издательства Просвещение Кроме этого, в Немецкий язык 7 класс Учебник (+ CD-ROM) И Л Бим , Л В Садомова ГДЗ по Немецкому языку 7 класс Бим ИЛ, Санникова ЛМ gdz-freeru/gdz/Dh7/1 Похожие Готовое Домашнее Задание ( ГДЗ ) по Немецкому языку за 7 класс Бим И Л , Санникова Л М, Садомова Л В — Ваша домашняя работа на 5+ ГДЗ 7 класс Немецкий язык Рабочая тетрадь ИЛ Бим, ЛВ Готовые ответы помогут Вам сверить задание по Немецкому языку Рабочая тетрадь за 7 класс , от автора: И Л Бим , Л В Садомова , Л М Фомичева, ГДЗ Немецкий язык за 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова онлайн ГДЗ поможет вам решить задание по Немецкому языку для 7 класса от авторов издания: И Л Бим , Л В Садомова В нем вы сможете сверить ответы к Гдз по немецкому в рабочий тетради по 7 классу авторы илбим л 16 мар 2015 г — гдз по немецкому в рабочий тетради по 7 классу авторы и л бим л всадомова « гдз рабочая тетрадь по немецкому языку и л бим л в садомова ж я ГДЗ : Готовые Домашние Задания по Русскому языку за 8 класс Немецкий язык 7 класс Бим ИЛ — Викирешебник Немецкий язык 7 класс Бим И Л Немецкий язык для 7-го класса Садомова Л В Учебник получил положительные заключения РАО и РАН на Не найдено: гдз Немецкий язык 7 класс Поурочные планы по учебнику И Л Бим, Л Аннотация: В пособии представлены планы уроков по немецкому языку, составленные в соответствии с учебником: И Л Бим , Л В Садомова , НА Не найдено: гдз ГДЗ по немецкому языку 7 класс рабочая тетрадь Бим, Садомова › Немецкий › 7 класс Похожие Решебник по немецкому языку за 7 класс авторы Бим , Садомова издательство Просвещение ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова ФГОС › ГДЗ › 7 класс › Немецкий язык › Бим И Л ГДЗ — поможет Вам сверить ответы к домашнему заданию по Немецкому языку И Л Бим , Л В Садомова 7 класс Решения выполнены к издательству ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс: Бим ИЛ c3094test60minutru/libraries/51/reshebnik-po-nemetskomu-1html И Л Бим ГДЗ к книге для чтения по немецкому языку за класс Бим И Л языку за 7 класс И Л Бим , Л В Садомова ;; Другие решебники? решебник по Немецкий язык, ИЛ Бим, ЛВ Садомова, ЛМ Санникова / Решебник wwwmegashporaru/gdz/0369/066426/ Немецкий язык 6 класс Учебник для общеобразовательных учреждений В 2 частях / И Л Бим , Л В Садомова , Л М Санникова; Российская академия Год издания — Библиотека АГГПУ irbisbigpibiyskru//cgiirbis_64exe?%3EA%3DБим,%20Инесса%20Львовна$%3 Книга для учителя [Текст] : к учебнику по немецкому языку для 7 класса средней школы / И Л Бим , Л В Садомова — 4-е изд — М : Просвещение, 1992 Картинки по запросу гдз по немецкому ил бим лвсадомова за 7 класс «id»:»Sj6PtEBCZybj7M:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:71,»oh»:811,»ou»:» «,»ow»:646,»pt»:»gdzputinaco/jpeg/nemeckii/bim/7klass/Arbeitsbuch/»,»rh»:»gdzputinaco»,»rid»:»TFva6o70WKxB6M»,»rt»:0,»ru»:» «,»sc»:1,»st»:»ГДЗ от Путина — ВСЕ решебники и рабочие тетради»,»th»:93,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcQP-8hCs19-TeGzkSjfin3Oi6tSmwoLGF6ST2S_JhwgDcrPGr66mC1vZl8″,»tw»:74 «id»:»iux9MS7U3IIEiM:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:59,»oh»:978,»ou»:» «,»ow»:649,»pt»:»gdzputinaco/jpeg/nemeckii/bim/7klass/Lehrbuch/I/1″,»rh»:»gdzputinaco»,»rid»:»TFva6o70WKxB6M»,»rt»:0,»ru»:» «,»sc»:1,»st»:»ГДЗ от Путина — ВСЕ решебники и рабочие тетради»,»th»:102,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcQ9Qat_DJADhV6v187cboALnBqnl0ociJgd9GOHGzeVFDW4bASzZYIJKg»,»tw»:68 «id»:»_EWDJzx3sAfyEM:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:102,»oh»:557,»ou»:» «,»ow»:646,»pt»:»gdzputinaco/jpeg/nemeckii/bim/7klass/Arbeitsbuch/»,»rh»:»gdzputinaco»,»rid»:»TFva6o70WKxB6M»,»rt»:0,»ru»:» «,»sc»:1,»st»:»ГДЗ от Путина — ВСЕ решебники и рабочие тетради»,»th»:90,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcSn5CDdYiopqR4ooGo04lzCZ3SuWrRNOTRhDK5nVyFVyOAl7-ZQ2dAGhw»,»tw»:104 «id»:»47JzoWk-MwHLLM:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:47,»oh»:1216,»ou»:» (Kleiner%20Wiederholungskurs)/009jpg»,»ow»:652,»pt»:»gdzputinaco/jpeg/nemeckii/bim/7klass/Lehrbuch/Nac»,»rh»:»gdzputinaco»,»rid»:»TFva6o70WKxB6M»,»rt»:0,»ru»:» «,»sc»:1,»st»:»ГДЗ от Путина — ВСЕ решебники и рабочие тетради»,»th»:114,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcTg1qna1OZiy4fbCjtvW5hoGCygFZoFNBw4jledokY-XYjeJtoWRPiwlw»,»tw»:61 «id»:»ZEzUpKUL7H74nM:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:95,»oh»:601,»ou»:» «,»ow»:650,»pt»:»five-pointsru/img/296/exercises/126704jpg»,»rh»:»five-pointsru»,»rid»:»lIZv4rRSWXIXRM»,»rt»:0,»ru»:» \u003d296″,»sc»:1,»st»:»Five-pointsru»,»th»:93,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcQb8UCiaFImCtF5e3mu0fAOIbf16uHHJFPlneAe4iTBscHJ-hrnTq2KQzM»,»tw»:100 «id»:»69Z70en4KUtRtM:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:118,»oh»:388,»ou»:» «,»ow»:637,»pt»:»gdzputinaco/jpeg/nemeckii/bim/7klass/Lehrbuch/I/2″,»rh»:»gdzputinaco»,»rid»:»TFva6o70WKxB6M»,»rt»:0,»ru»:» «,»sc»:1,»st»:»ГДЗ от Путина — ВСЕ решебники и рабочие тетради»,»th»:90,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcR5keeqCd_Fc7PcsNlWEfFh4LzKIDvu071WS1DnP2MhhTZntusSzp0hGiPU»,»tw»:148 «id»:»LZSN2Tf9jk0Y_M:»,»ml»:»600″:»bh»:90,»bw»:84,»oh»:677,»ou»:» «,»ow»:646,»pt»:»gdzputinaco/jpeg/nemeckii/bim/7klass/Arbeitsbuch/»,»rh»:»gdzputinaco»,»rid»:»TFva6o70WKxB6M»,»rt»:0,»ru»:» «,»sc»:1,»st»:»ГДЗ от Путина — ВСЕ решебники и рабочие тетради»,»th»:90,»tu»:» \u003dtbn:ANd9GcQnBqEm-ZRWUgcywRbF2JSLg1DFMK8JoTXY9ANFNqvsTOpMuj6Fl_Xm1IM»,»tw»:86 Другие картинки по запросу «гдз по немецкому ил бим лвсадомова за 7 класс» Жалоба отправлена Пожаловаться на картинки Благодарим за замечания Пожаловаться на другую картинку Пожаловаться на содержание картинки Отмена Пожаловаться Все результаты ГДЗ решебник по немецкому языку 7 класс Бим Садомова › 7 класс › Немецкий язык Здесь представлены ответы к учебнику и рабочей тетради оранжевого цвета по немецкому языку 7 класс Бим Садомова Санникова Вы можете Учебник Немецкий язык 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова 2011 › Учебники за 7 класс › Немецкий язык Полный и качественный учебник Немецкий язык 7 класс И Л Бим , Л В Садомова Учебники за 7 класс > Немецкий язык > И Л Бим , Л В Садомова Задание №3: ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс, ответ к Учебнику › 7 класс › Немецкий язык › Бим И Л › Задание №3 ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс от Бим : Задание №3 из Учебника Немецкий язык за 7 класс от Бим Авторы: И Л Бим , Л В Садомова ГДЗ по немецкому языку, 7 класс Бим, Садомова » Все для 7 all7classru/13-gdz-po-nemeckomu-yazyku-7-klass-bim-sadomovahtml Похожие Янусика: На оранжевый учебник скажите ,пожалуйста, какой сайт?? Плиз, пожалуйста, я вас очень прошу нужен, 7 класс Бим и Садомова domosedochka: Зборник популярных игр за 2013 год танюня: я люблю немиц love Решебник по Немецкому языку для 7 класса ИЛ Бим ГДЗ Похожие авторы: И Л Бим , Л В Садомова ГДЗ к рабочей тетради 7 класс Бим можно скачать здесь ГДЗ к книге для чтения по немецкому языку за 7-9 класс Бим ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова › ГДЗ › 7 класс › Немецкий язык › ИЛ Бим Похожие Решебник по Немецкому языку для 7 класса , авторы учебника : И Л Бим , Л В Садомова на 2017-2018 год ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс ИЛ Бим, ЛВ Садомова авторы: И Л Бим , Л В Садомова ГДЗ к рабочей тетради 7 класс Бим можно скачать здесь ГДЗ к книге для чтения по немецкому языку за 7-9 класс Бим Гдз по Немецкому языку за 7 класс, авторы ИЛ Бим, ЛВ Садомова Похожие Подробные гдз и решебник по Немецкому языку для 7 класса , авторы учебника: И Л Бим , Л В Садомова на 2017-2018 год ГДЗ по Немецкому языку для 7 класса ИЛ Бим, ЛВ Садомова на 5 ГДЗ по Немецкому языку для 7 класса И Л Бим , Л В Садомова ФГОС 7 класс Бим · ГДЗ к книге для чтения по немецкому языку за 7-9 класс Бим И Л Пояснения к фильтрации результатов Мы скрыли некоторые результаты, которые очень похожи на уже представленные выше (46) Показать скрытые результаты В ответ на жалобу, поданную в соответствии с Законом США «Об авторском праве в цифровую эпоху», мы удалили некоторые результаты (25) с этой страницы Вы можете ознакомиться с жалобой на сайте LumenDatabaseorg Некоторые результаты поиска могли быть удалены в соответствии с местным законодательством Подробнее Вместе с гдз по немецкому ил бим лвсадомова за 7 класс часто ищут гдз по немецкому 7 класс бим садомова артемова гдз по немецкому 7 класс аверин гдз по немецкому 7 класс горизонты учебник гитем 7 класс немецкий язык гдз по немецкому языку бим оранжевый учебник немецкий язык 7 класс книга для чтения перевод гдз по немецкому 7 класс бим еуроки учебник немецкого языка 7 класс бим читать онлайн Ссылки в нижнем колонтитуле Россия — Подробнее… Справка Отправить отзыв Конфиденциальность Условия Аккаунт Поиск Карты YouTube Play Новости Почта Контакты Диск Календарь Google+ Переводчик Фото Ещё Покупки Документы Blogger Hangouts Google Keep Jamboard Подборки Другие сервисы Google

Яндекс Яндекс Найти Поиск Поиск Картинки Видео Карты Маркет Новости ТВ онлайн Знатоки Коллекции Музыка Переводчик Диск Почта Все Ещё Дополнительная информация о запросе Показаны результаты для Нижнего Новгорода Москва 1 ГДЗ по немецкому языку 7 класс Бим gdzmaniacom › …nemeckij…7-klass-bim-sadomovahtml Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Авторы: И Л Бим , Л В Садомова Перед вами готовые домашние задания с онлайн ответами к учебнику по немецкому языку за 7 класс автора И Л Бим , Л В Садомова 2 ГДЗ по Немецкому языку 7 класс И Л Бим , Л В Садомова GdzPutinacom › Гдз за 7 класс › Немецкий язык › Бим Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Немецкий язык 7 класс И Л Бим учебник Самым сложным препятствием для людей, не желающих А чтобы помочь ученику эффективно и грамотно освоить этот предмет авторы Бим И Л и Садомова Л В разработали ГДЗ по немецкому языку Читать ещё Немецкий язык 7 класс И Л Бим учебник Самым сложным препятствием для людей, не желающих ограничивать себя рамками одного государства, является языковый барьер Немецкий — наиболее часто употребляемый язык в научном сообществе Может быть поэтому некоторые школьники выбрали изучением иностранного языка именно немецкий А чтобы помочь ученику эффективно и грамотно освоить этот предмет авторы Бим И Л и Садомова Л В разработали ГДЗ по немецкому языку за 7 класс В этом пособии находятся уже выполненные упражнения, которые помогут подготовиться к контрольным работам Скрыть 3 ГДЗ Немецкий язык 7 класс Бим И Л , Садомова uchebenet › ГДЗ › 7 класс › Немецкий язык › Немецкий язык 7 класс Автор Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Ответы для гдз по учебнику Немецкий язык 7 класс 2015 год от автора Бим И Л , Садомова Л В издательства Просвещение Автор: Бим И Л , Садомова Л В Класс : 7 класс Читать ещё Ответы для гдз по учебнику Немецкий язык 7 класс 2015 год от автора Бим И Л , Садомова Л В издательства Просвещение Автор: Бим И Л , Садомова Л В Класс : 7 класс Изд: Просвещение Год: 2015 Выберите ваше задание : ARBEITSBUCH Nach den Sommerferien (Kleiner Wiederholungskurs) Скрыть 4 Решебник и ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс , авторы gdz-putinanet › 7-klass-nemeckij-yazyk-bim Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ по Немецкому языку 7 класс авторы: И Л Бим , Л В Садомова Используя ГДЗ по немецкому языку 7 класса , учащийся способны освоить немецкий язык самостоятельно, без помощи учителей и родителей Читать ещё ГДЗ по Немецкому языку 7 класс авторы: И Л Бим , Л В Садомова Решебник по немецкому языку 7 класса авторов: Бим , Садомова помогает ученикам изучать иностранный предмет Решебник — это полное издание с ответами на вопросы и решением всех упражнений из учебников Deutsch Lehrbuch Бима Используя ГДЗ по немецкому языку 7 класса , учащийся способны освоить немецкий язык самостоятельно, без помощи учителей и родителей Осваивать предмет можно не только в школе, но и дома в любое удобное время Ученик может определить интересующий его уровень обучения и углубить познания Скрыть 5 ГДЗ решебник по немецкому языку 7 класс Бим gdzgoorg › 7 класс › Немецкий язык › Садомова Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Для изучения немецкого языка в 7 классе рекомендован учебник Бим , Садомова Для облегчения и значительного ускорения процессов получения знаний изданы ГДЗ 6 Решебник по немецкому языку за 7 класс И Л Бим | Гдз GDZguru › reshebniki/7-klass/nemeckiy_yazik/bim/ Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ : Онлайн готовые домашние задания по немецкому языку ФГОС за 7 класс , автор И Л Бим , Л В Садомова , спиши решения и ответы на ГДЗ гуру 7 ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс : Бим И Л Решебник GDZru › class-7/nemeckiy_yazik/bim/ Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ : Спиши готовые домашние задания по немецкому языку за 7 класс , решебник И Л Бим , ФГОС, онлайн ответы на GDZRU ГДЗ по немецкому языку полностью соответствует стандартам общеобразовательных школ и разработано по программе, предлагаемой для учащихся седьмых классов Читать ещё ГДЗ : Спиши готовые домашние задания по немецкому языку за 7 класс , решебник И Л Бим , ФГОС, онлайн ответы на GDZRU ГДЗ по немецкому языку полностью соответствует стандартам общеобразовательных школ и разработано по программе, предлагаемой для учащихся седьмых классов Пособие имеет классическое строение, все детальные ответы на упражнения и школьные задания в нем расположены в отдельных разделах, как и в учебнике Дополнительно в нем представлены и тексты для чтения, что значительно расширяет словарный запас и улучшает знание иностранного языка Скрыть 8 ГДЗ по немецкому языку 7 класс рабочая тетрадь Бим eurokiorg › gdz…7_klass…po-nemetskomu…7-klass-bim… Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте ГДЗ рабочая тетрадь по немецкому языку 7 класс Бим , Садомова Просвещение стр 3 стр 4 стр 5 стр 6 стр 7 стр 8 стр 9 стр 11 стр 12 стр 13 стр Читать ещё ГДЗ рабочая тетрадь по немецкому языку 7 класс Бим , Садомова Просвещение стр 3 стр 4 стр 5 стр 6 стр 7 стр 8 стр 9 стр 11 стр 12 стр 13 стр 14 стр 15 стр 16 стр 17 стр 18 стр 19 стр 20 стр 21 стр 22 стр 23 стр 24 стр 25 стр 26 стр 27 стр 28 стр 29 стр 30 стр 31 стр 32 стр 33 стр 34 стр 35 стр 36 стр 37 стр 38 стр 39 стр 40 стр 41 стр 42 стр 44 стр 45 стр 46 стр 48 стр 49 стр 50 стр 51 стр 52 стр 53 стр 54 стр 55 стр 56 стр 57 стр 58 стр 59 стр 60 стр 62 стр 65 стр 66 стр 67 стр 68 стр 69 стр 70 стр 71 стр 74 стр 75 стр 76 стр Скрыть 9 ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги reshebnik5-11ru › 6 класс › Бим Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Главная ГДЗ 6 класс ГДЗ 7 класс Немецкий язык 7 класс ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: И Л Бим , Л В Садомова , НА Артемова В шести государствах немецкий язык является государственным языком: в Федеративной Республике Германия, в Австрии, в Лихтенштейне, в части Читать ещё Главная ГДЗ 6 класс ГДЗ 7 класс Немецкий язык 7 класс ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: И Л Бим , Л В Садомова , НА Артемова Страница 1 из 20 ГДЗ немецкий язык за 7 класс к учебнику Шаги 3: И Л Бим и И Л Бим , Л В Садомова , НА Артемова Книга для чтения / Сост В шести государствах немецкий язык является государственным языком: в Федеративной Республике Германия, в Австрии, в Лихтенштейне, в части Швейцарии, в части Люксембурга и в Бельгии Для ста миллионов людей немецкий — родной язык: в Федеративной Республике Германия, в Австрии, в Швейцарии, в Люксембурге, в Лихтенштейне, в Бельгии и во многих других странах, также и в некоторых уголках России Скрыть 10 ГДЗ по Немецкому языку за 7 класс — автор И Л Бим shkololoru › gdz-nemeckiy-yazyk/7-klass-bim Сохранённая копия Показать ещё с сайта Пожаловаться Информация о сайте Это решебник для учебника по Немецкому языку для 7 класса авторов И Л Бим , Л В Садомова Готовые домашние задания по немецкому языку помогут проверить себя или быстро узнать решение и списать ответ Читать ещё Это решебник для учебника по Немецкому языку для 7 класса авторов И Л Бим , Л В Садомова Готовые домашние задания по немецкому языку помогут проверить себя или быстро узнать решение и списать ответ В решебнике содержится упражнений с ответами — Ученики 7 классов могут бесплатно пользоваться этим ГДЗ , чтобы проверять свою работу на правильность Спиши и поделись с другими! Скрыть Вместе с « гдз по немецкому ил бим лвсадомова за 7 класс » ищут: переводчик с немецкого на русский немецкий язык гдз по русскому языку 7 класс ладыженская гдз от путина гдз по математике гдз по математике 5 класс гдз по русскому языку 6 класс ладыженская гдз по алгебре 7 класс мерзляк гдз по геометрии 7 -9 класс атанасян гдз по математике 6 класс виленкин 1 2 3 4 5 дальше Браузер Ускоряет загрузку файлов при медленном соединении 0+ Установить

Вориностат и метформин сенсибилизируют клетки NSCLC, устойчивые к EGFR-TKI, посредством индукции BIM-зависимого апоптоза

Oncotarget. 2017 7 ноября; 8 (55): 93825–93838.

Hengyi Chen

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Daping, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

Yubo Wang

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Daping, Третий военно-медицинский университет, Чунцин

Caiyu Lin

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Daping, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

Conghua Lu

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Daping, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

Руи Хан

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Дапинг, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

Линь Цзяо

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Дапинг, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

Li Li

1 Департамент Re респираторных заболеваний, Госпиталь Daping, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

Yong He

1 Отделение респираторных заболеваний, Госпиталь Daping, Третий военно-медицинский университет, Чунцин, Китай

1 Отделение респираторных заболеваний, Daping Госпиталь Третьего военно-медицинского университета, Чунцин, Китай

Поступило 4 апреля 2017 г .; Принята в печать 17 августа 2017 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License 3.0 (CC BY 3.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника. были процитированы другими статьями в PMC.

Abstract

Существует тесная взаимосвязь между низкой экспрессией BIM и устойчивостью к ингибитору тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR-TKI). Вориностат представляет собой ингибитор пангистоновой деацетилазы (HDACi), который увеличивает экспрессию BIM в различных типах опухолевых клеток, однако этот эффект ослабляется высокой экспрессией антиапоптотических белков в немелкоклеточном раке легкого, устойчивом к EGFR-TKI (NSCLC). ) клетки.Вориностат в сочетании с метформином — соединением, которое может ингибировать экспрессию антиапоптотических белков, может взаимодействовать для активации апоптотической передачи сигналов и преодоления устойчивости к EGFR-TKI. Это исследование было направлено на изучение кооперативного эффекта и оценку возможных молекулярных механизмов. Результаты показали, что вориностат в сочетании с гефитинибом увеличивал экспрессию BIM и повышал чувствительность клеток NSCLC, устойчивых к EGFR-TKI, к гефитинибу, одновременное добавление метформина, очевидно, могло ингибировать экспрессию антиапоптотических белков и дополнительно повышать уровни экспрессии BIM и BAX, а также в результате дополнительно улучшилась чувствительность гефитиниба как к клеткам NSCLC, имеющим внутреннюю, так и приобретенную устойчивость к EGFR-TKI.Кроме того, аутофагия, вызванная гефитинибом и вориностатом, может быть значительно подавлена ​​метформином, что также может способствовать усилению апоптоза и повышению чувствительности гефитиниба. Эти результаты позволяют предположить, что комбинация вориностата и метформина может представлять новую стратегию преодоления устойчивости к EGFR-TKI, связанной с BIM-зависимым апоптозом, в более крупных гетерогенных популяциях.

Ключевые слова: вориностат, метформин, BIM, апоптоз, устойчивость к EGFR-TKI

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на то, что ингибитор тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR-TKI) продемонстрировал огромную терапевтическую эффективность, устойчивость считается почти неизбежной основная клиническая проблема [1].EGFR-TKI 3-го поколения, представленные осимертинибом, проявляют мощные эффекты против мутации устойчивости к T790 M [2, 3], но также неизбежно сталкиваются с проблемой приобретенной устойчивости [4, 5]. В настоящее время EGFR-TKI 1-го поколения все еще являются стандартным лечением пациентов с запущенным немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). Соответственно, дальнейшие исследования комбинированных стратегий для преодоления устойчивости к EGFR-TKI имеют важное клиническое значение и применимое значение.

Предыдущее исследование показало, что проапоптотический сигнальный белок Bh4-only BIM в значительной степени связан с клиническими эффектами EGFR-TKI [6].Уровни экспрессии BIM от низкого до среднего [6] тесно связаны с устойчивостью к EGFR-TKI несколькими механизмами, включая вторичную мутацию T790M [7], амплификацию Met [4], активацию сигнального пути PI3K / AKT / mTOR и др. [8 ]. Таким образом, кажется правдоподобным, что преодоление устойчивости к EGFR-TKI с помощью множества механизмов может быть прямым подходом, который зависит от усиления экспрессии BIM [9].

Исследования показывают, что вориностат, который является ингибитором пангистоновой деацетилазы (HDACi), может эпигенетически восстанавливать функцию BIM и чувствительность клеток NSCLC, экспрессирующих полиморфизм делеции BIM, к EGFR-TKI [10].Вориностат считается оптимальным методом выбора в клинике при использовании в сочетании с химиотерапевтической или молекулярной таргетной терапией, в значительной степени из-за активации транскрипции BIM [11, 12] и контролируемых клинических побочных эффектов. Однако комбинированная терапия HDACi и эрлотинибом демонстрирует ограниченную эффективность у неотобранных пациентов с распространенным НМРЛ [13]. Возможная причина этого заключается в знании того, что апоптоз, индуцированный HDACi, ослабляется семейством антиапоптотических белков B-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2), включая Bcl-xL и Mcl-1 [14], которые были показано, что его активность повышается в резистентных к EGFR-TKI клетках NSCLC [15, 16].Более того, HDACi активирует BIM и усиливает связывание BIM / Bcl-2, что сильно ослабляет апоптоз [17]. Кроме того, аутофагия, индуцированная HDACi или EGFR-TKI, может переключаться с проапоптотической функции на сигнал, способствующий выживанию, который стимулирует приобретенную устойчивость [17-19]. Таким образом, вориностат в сочетании с лекарствами, которые способны ингибировать экспрессию антиапоптотических белков, может представлять собой многообещающую стратегию повышения чувствительности EGFR-TKI и преодоления устойчивости к EGFR-TKI.

Гипогликемический препарат метформин проявляет адъювантное противораковое действие [20].Наши предыдущие исследования также показали, что метформин может повышать чувствительность EGFR-TKI в EGFR-TKI резистентных клетках NSCLC [21], использование метформина было связано с улучшением выживаемости и отсрочкой появления приобретенной устойчивости к EGFR-TKI у пациентов с NSCLC и сахарным диабетом 2 типа. [22]. Примечательно, что ранее сообщалось, что метформин может ингибировать экспрессию антиапоптотических белков, таких как Bcl-2 и Mcl-1 [23], таким образом, он может усиливать апоптоз, индуцированный HDACi. Кроме того, метформин может напрямую увеличивать экспрессию BIM, блокируя сигнальный путь AKT [21, 24].Однако метформина, по-видимому, недостаточно для лечения рака, что увеличивает потребность в комбинации этого агента с другими лекарствами с целью выявления его синергетического или кооперативного цитотоксического действия [25].

Вместе взятые, метформин и вориностат могут взаимодействовать, чтобы воздействовать на сигнальный путь BIM, чтобы преодолеть устойчивость к TKI с помощью суперсоставных эффектов. Настоящее исследование направлено на изучение влияния и механизмов комбинированного применения метформина и вориностата на резистентность к TKI.Предполагается, что такие исследования продемонстрируют взаимодополняющий синергизм совместного лечения метформином и вориностатом на чувствительность к TKI, тем самым предоставив новый терапевтический подход, который можно было бы в целом использовать для лечения пациентов с НМРЛ с мутациями EGFR.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Метформин в сочетании с вориностатом синергетически усиливал индуцированный гефитинибом апоптоз в резистентных к EGFR-TKI клетках NSCLC

Для оценки взаимодействия гефитиниба с вориностатом и метформином, h2975, PC-9GR3 и дополнительные клетки лечились комбинацией фиксированных доз (т.е., вориностат, 0,5 мкМ, метформин, 1 мМ, и возрастающие концентрации гефитиниба) в течение 48 часов, после чего измеряли ингибирование роста с помощью анализа жизнеспособности МТТ. По сравнению с одним гефитинибом или гефитинибом в комбинации с вориностатом (0,5 мкМ) или метформином (1 мМ), все типы клеток, обработанные комбинацией фиксированных доз (т.е. гефитиниб плюс вориностат и метформин), демонстрировали явно сниженную жизнеспособность (рисунок). .

Метформин и вориностат синергетически усиливали индуцированную гефитинибом цитотоксичность в линиях клеток NSCLC, устойчивых к EGFR-TKI.

(A) Вориностат и / или метформин повышали чувствительность EGFR-TKI-устойчивых клеток к гефитинибу.Жизнеспособность клеток h2975, PC-9GR и h2650-M3, которые обрабатывали указанными дозами гефитиниба в течение 48 часов, оценивали с помощью анализа MTT. * p <0,05 по сравнению с лечением только гефитинибом; # p <0,05 по сравнению с гефитинибом в сочетании с вориностатом или метформином. (B) Значения индекса комбинации (ДИ) для комбинированного лечения гефитинибом, вориностатом и метформином были рассчитаны с использованием программного инструмента CompnSyn (Paramus, NJ, USA).Представленные данные были репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов. Gef: гефитиниб; САХА: вориностат; Встретил: метформин.

Все значения индекса комбинации (ДИ) были <1, за исключением комбинации метформина (1 мМ), вориностата (0,5 мкМ) и гефитиниба (0,25 мкМ) в клетках h2650-M3 (рисунок), что указывает на наличие было синергетическое взаимодействие между вориностатом, метформином и гефитинибом. Кроме того, было обнаружено, что 48-часовая культура в среде, содержащей вориностат (0,5 мкМ) и метформин (1 мМ), может дополнительно усиливать эффекты гефитиниба на пролиферацию и инвазивность клеток h2975 (дополнительные рисунки 2A, 2B) и клеток PC-9GR ( Дополнительный рисунок 3A, 3B).Следует отметить, что сами по себе вориностат (0,5 мкМ) и метформин (1 мМ) лишь незначительно снижали жизнеспособность клеток, использованных в исследовании (дополнительные рисунки 4A-4C).

Затем мы выполнили проточный цитометрический анализ для определения эффекта, способствующего апоптозу, после комбинированного применения вориностата и метформина в клетках НМРЛ с внутренней или приобретенной устойчивостью к гефитинибу. Хотя лечение только вориностатом (0,5 мкМ в течение 48 часов) или метформином (1 мМ в течение 48 часов) мало влияло на апоптоз клеток h2975 или PC-9GR, вориностат или метформин значительно увеличивали апоптоз, индуцированный гефитинибом в клетках h2975 и PC-9GR. клеток, а совместное применение вориностата и метформина еще больше усилило этот эффект (рис. и).

( A и B ) Метформин и вориностат показали синергетический апоптоз, который стимулировался гефитинибом в EGFR-TKI-устойчивых клеточных линиях NSCLC. Проточный цитометрический анализ путем окрашивания аннексином V – FITC / PI выявил индукцию апоптоза. Изображения были репрезентативными для трех независимых экспериментов. * p <0,05 по сравнению с лечением только гефитинибом, # p <0,05 по сравнению с гефитинибом в сочетании с вориностатом или метформином, Δ p <0.05 по сравнению с контрольными (необработанными) клетками. Gef: гефитиниб; САХА: вориностат; Встретил: метформин.

Метформин в сочетании с вориностатом и гефитинибом регулирует сигнальный путь апоптоза в клетках NSCLC, устойчивых к EGFR-TKI. на сигнальном пути апоптоза. Результаты вестерн-блоттинга показали, что комбинированное лечение гефитинибом и вориностатом в клетках h2975 снижает экспрессию Bcl-xL и p-Mcl-1, в то время как не влияет на экспрессию BIM и BAX по сравнению с одним гефитинибом.В клетках PC-9GR и h2650-M3 комбинированное использование гефитиниба и вориностата подавляло экспрессию p-Mcl-1 и усиливало экспрессию BIM и BAX, не влияя на Bcl-xL. Более того, гефитиниб в сочетании с вориностатом может повышать экспрессию Bcl-2 во всех клеточных линиях. Важно отметить, что одновременное добавление метформина может, очевидно, подавлять экспрессию антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-xL и p-Mcl-1 и дополнительно повышать уровни экспрессии BIM и BAX (рисунок и дополнительный рисунок 5).

Метформин в комбинации с вориностатом и гефитинибом регулирует сигнальный путь апоптоза в EGFR-TKI резистентных клетках NSCLC

(A) h2975 и (B) Клетки PC-9GR обрабатывали вориностатом (0,5 мкМ) и / или гефитиниб (IC25) с / без метформина (1 мМ) в течение 48 часов. Лизаты цельноклеточного белка подвергали иммуноблоттингу с указанными антителами. Относительную экспрессию BIM, BAX, Bcl-xL, Bcl-2 и p-Mcl-1 выражали как среднее ± стандарт из трех независимых экспериментов. * р <0,001; # p <0,05; NS: не значимо (t-критерий Стьюдента). Gef: гефитиниб; САХА: вориностат; Встретил: метформин.

Поскольку исследования показали, что индукция BIM была следствием как посттрансляционной модификации, так и индукции транскрипции, которые зависят от ингибирования ERK и пути AKT [26, 27], мы также обнаружили, что эта комбинация значительно снижает фосфорилирование ERK и AKT. , и ингибировал фосфорилирование EGFR (рисунок и дополнительный рисунок 5).Эти данные продемонстрировали, что комбинированное использование вориностата, метформина и гефитиниба может значительно активировать путь апоптоза в клетках NSCLC, устойчивых к EGFR-TKI.

BIM играет важную функциональную роль в синергетическом эффекте вориностата и метформина

Чтобы определить, играет ли BIM важную роль в стратегии комбинированного лечения в индукции апоптоза, мы использовали малую интерферирующую РНК, нацеленную на BIM в h2975 и PC-9GR. клеток и подвергнутые проточно-цитометрическому анализу окрашивания аннексином V / пропидиум йодидом (PI) (рисунок). Наши результаты показали, что апоптоз значительно ослаблялся при комбинированной терапии за счет нокдауна BIM в обеих клеточных линиях (рисунок и).

Нокдаун экспрессии BIM ослабляет апоптоз.

(A) h2975 и (B) Клетки PC-9GR трансфицировали миРНК BIM или контрольными олигонуклеотидами в течение 48 часов соответственно. Затем собирали лизаты и анализировали белки с помощью иммуноблоттинга. (C) h2975 и (D) PC-9GR клетки трансфицировали siRNA, которые нацелены на BIM за 48 часов до обработки лекарством (гефитиниб отдельно или в сочетании с вориностатом и метформином) в течение 48 часов, а затем апоптотические клетки подсчитывали с помощью проточно-цитометрический анализ путем окрашивания аннексином V – FITC / PI. * p <0,05 по сравнению с отрицательным контролем, получавшим схему из трех препаратов; # p <0,05 по сравнению с отрицательным контролем, который лечили только гефитинибом. (E) Иммуногистохимические (ИГХ) анализы экспрессии BIM в опухолевых тканях пациентов с НМРЛ, демонстрирующих мутантный EGFR. Интенсивность окрашивания при НМРЛ оценивалась от 1 до 3. (Сплошные линии на верхней и нижней панелях представляют 200 и 100 мкм соответственно). (F) Сравнение экспрессии BIM с помощью PFS. Gef: гефитиниб; САХА: вориностат; Встречались: метформин; ВБП: выживаемость без прогрессирования.

Затем мы изучили взаимосвязь между уровнем экспрессии BIM и клиническими исходами гефитиниба у пациентов с НМРЛ. Ретроспективно были идентифицированы 18 пациентов с выживаемостью без прогрессирования (ВБП) более 12 месяцев и 18 сопоставимых пациентов с ВБП менее или равной 3 месяцам (критерии соответствия включали пол, возраст, стадию и степень) (клинические характеристики показаны в Дополнительная таблица 1).Как показано на рисунке, значительно более высокая экспрессия BIM была обнаружена у пациентов с PFS более 12 месяцев.

Эти данные показали, что BIM играет важную роль в качестве регулятора смерти при апоптозе, вызванном комбинированным лечением метформином, вориностатом и гефитинибом, и экспрессия BIM может сильно коррелировать с прогнозом пациентов, принимающих гефитиниб.

Метформин подавлял аутофагию, вызванную одновременным лечением вориностатом и гефитинибом

Учитывая, что гефитиниб и вориностат вызывают аутофагию в клетках НМРЛ [28, 29], и существует тесная взаимосвязь между аутофагией и апоптозом, мы затем определили, влияет ли метформин на аутофагию. была вызвана лечением гефитинибом и вориностатом.При аутофагической активации цитозольная форма LC3 (LC3-I) расщепляется, липидируется и превращается в конъюгированную форму LC3 (LC3-II), после чего она вставляется в мембрану аутофагосомы [30]. В клетках h2975 и PC-9GR зеленые флуоресцентные точки LC3, окрашенные антителом против LC3, визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. В этом анализе мы обнаружили, что комбинированная обработка вориностатом и гефитинибом приводила к заметному увеличению точек LC3 по сравнению с клетками, обработанными только вориностатом или гефитинибом (рис. И).Тем не менее, в сочетании с вориностатом гефитиниб индуцировал более высокие уровни конверсии LC3-II (фиг. И) по сравнению с необработанным контролем, а также в условиях лечения только вориностатом или гефитинибом. Кроме того, активация Beclin-1 и подавление P62 также рассматривались как факторы активации аутофагии. Результаты показали, что обработка либо одним вориностатом, либо вориностатом в сочетании с гефитинибом явно индуцировала фосфорилирование Beclin-1 в клетках h2975 и PC-9GR и снижала уровни P62 в клетках PC-9GR по сравнению с необработанными контролями (фиг. И).Анализ просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) показал, что в клетках, обработанных гефитинибом или вориностатом, появились многочисленные аутофагические вакуоли. После комбинированного лечения гефитинибом и вориностатом в клетках наблюдалось значительно увеличенное количество аутофагических вакуолей по сравнению с клетками, обработанными каждым агентом по отдельности (фиг. И).

Изменения аутофагии, наблюдаемые в клетках h2975 и PC-9GR, обработанных вориностатом и / или гефитинибом с / без метформина

клетки h2975 и PC-9GR обрабатывали вориностатом (0.5 мкМ), метформин (1 мМ) и гефитиниб (IC25) по отдельности или в комбинации в течение 48 часов. В клетках (A) h2975 и (D) PC-9GR визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии показала, что только вориностат и гефитиниб увеличивают флуоресценцию точечных точек. Кроме того, одновременное лечение вориностатом и гефитинибом значительно усиливало флуоресценцию точечных точек, в то время как метформин обращал вспять увеличение флуоресценции точечных точек, которое в противном случае индуцировалось лечением вориностатом и / или гефитинибом. Масштабные линейки: 30 мкм. (B) и (E) показали, что лизаты белков цельных клеток из клеток h2975 и PC-9GR при дифференциальной обработке подвергались иммуноблоттингу с антителами, как указано соответственно.Экспрессию β-актина использовали в качестве контроля нагрузки. (C) и (F) Типичные аутофагические структуры и количественные данные, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии в клетках h2975 и PC-9GR, соответственно. Шкала: 0,5 мкм. Аналогичные результаты были получены в трех независимых экспериментах. * p <0,001 по сравнению с контрольными (необработанными) клетками; # p <0,001 по сравнению с лечением только гефитинибом или вориностатом; Δ п <0.001 по сравнению с гефитинибом в сочетании с вориностатом. Gef: гефитиниб; САХА: вориностат; Встретил: метформин.

И наоборот, лечение метформином заметно ингибировало аутофагию, вызванную вориностатом и гефитинибом (рис. И), что проявлялось в заметно сниженном превращении LC3-I в LC3-II и фосфорилировании Beclin-1, в то время как уровни P62 в h2975 увеличивались. и клетки PC-9GR (рисунок а). Результаты ПЭМ также продемонстрировали, что добавление метформина к гефитинибу и вориностату значительно уменьшало аутофагосомы и аутофагические структуры в клетках h2975 и PC-9GR (рисунок и).

Результаты показали, что комбинированное использование гефитиниба и вориностата может усиливать аутофагию, но более низкие дозы метформина, когда используются в качестве аддитивных свойств, смягчают этот эффект, что приводит к заметному ингибированию аутофагии.

Ингибирование аутофагии способствует усилению апоптоза, вызванного комбинированным лечением вориностатом и гефитинибом

Поскольку аутофагия тесно связана с апоптозом [31, 32] и может быть вовлечена в устойчивость НМРЛ к EGFR-TKI [33], h2975 и Клетки PC-9GR обрабатывали ингибитором аутофагии спаутином-1 (10 мкМ), чтобы препятствовать комбинированным эффектам вориностата и гефитиниба.Как показано на рисунке, в сочетании с вориностатом и гефитинибом спаутин-1 значительно усиливал снижение жизнеспособности клеток. Более того, совместное лечение спаутином-1 значительно увеличивало апоптоз, который был индуцирован вориностатом и гефитинибом в клетках PC-9GR (рисунок). Кроме того, анализ вестерн-блоттинга показал, что спаутин-1 эффективно активировал путь апоптоза, о чем свидетельствует повышенная экспрессия проапоптотические белки BIM и BAX, снижали Bcl-2 и активировали Mcl-1 (рисунок). При обработке одним спаутином-1 (10 мкМ) в течение 48 часов незначительно снижалась жизнеспособность клеток h2975 и PC-9GR (дополнительные рисунки 3A и 3B).Эти данные показали, что усиление апоптоза, вызванное комбинированным лечением вориностатом и гефитинибом, частично зависело от ингибирования аутофагии в EGFR-TKI-устойчивых клетках NSCLC.

Ингибирование роста и индукция апоптоза при комбинированном лечении вориностатом и гефитинибом усиливались за счет ингибирования аутофагии

(A) h2975 и клетки PC-9GR обрабатывали указанными дозами гефитиниба и / или вориностата (0,5 мкМ) с / без мощного ингибитора аутофагии спаутина-1 (10 мкМ) в течение 48 часов.МТТ-анализ определял эффекты ингибирования роста. * p <0,05 по сравнению с лечением только гефитинибом; # p <0,05 по сравнению с комбинированным лечением вориностатом и гефитинибом. (B) Клетки PC-9GR обрабатывали только гефитинибом или в сочетании с вориностатом со спаутином-1 (10 мкМ) или без него (10 мкМ) в течение 48 часов. При проточном цитометрическом анализе наблюдались изменения в апоптозе. * p <0,05 по сравнению с лечением только гефитинибом; # p <0.05 по сравнению с комбинированным лечением вориностатом и гефитинибом. (C) Лизаты цельноклеточного белка из клеток PC-9GR, которые обрабатывали гефитинибом и / или вориностатом со спаутином-1 или без него в течение 48 часов, подвергали иммуноблоттингу с использованием антител, как указано. * р <0,001; # p <0,05; NS: не значимо (t-критерий Стьюдента). Gef: гефитиниб; САХА: вориностат; Встретил: метформин.

ОБСУЖДЕНИЕ

В текущем исследовании впервые сообщается, что метформин в сочетании с вориностатом оказывает синергетический эффект в повышении чувствительности устойчивых к EGFR-TKI клеток NSCLC к гефитинибу.Эффект этой комбинации против устойчивости к гефитинибу был приписан его способности индуцировать BIM-зависимый апоптоз. Соответственно, мы представили обоснование и экспериментальные доказательства в поддержку комбинации вориностата и метформина в преодолении устойчивости к гефитинибу у пациентов с НМРЛ, устойчивых к EGFR-TKI.

Комбинированные стратегии в настоящее время изучаются и постепенно становятся центром внимания для преодоления устойчивости к EGFR-TKI. Однако этот подход все еще требует доработки и оптимизации в будущем [34].Основываясь на его надежных противоопухолевых эффектах, роль, которую pan-HDACis играет в адъювантной терапии НМРЛ, особенно в сочетании с другими химиотерапевтическими агентами и молекулярной таргетной терапией [29, 35, 36], привлекла повышенное внимание. Хотя HDACi вызывает множество противоопухолевых эффектов, включая индукцию дифференцировки, ингибирование пролиферации и т.д., их основной механизм противоопухолевой активности заключается в индукции апоптоза [37]. Было обнаружено, что ингибиторы HDAC индуцируют апоптоз в определенных типах клеток NSCLC в сочетании с необратимым EGFR-TKI или пеметрекседом [29, 35]. Однако отдельные опухолевые клетки имеют гетерогенные ответы на апоптоз, индуцированный HDACi [38], и нет Значительное улучшение общего результата у пациентов с запущенным НМРЛ, получавших HDACi и эрлотиниб [13].

В нашем настоящем исследовании мы также показали, что вориностат pan-HDACi некоторым образом увеличивает чувствительность клеток NSCLC устойчивости к EGFR-TKI к гефитинибу. В клеточных линиях NSCLC с другим механизмом устойчивости к EGFR-TKI, в то время как гефитиниб в комбинации с вориностатом приводил к значительному снижению жизнеспособности клеток и усилению апоптоза, мы отметили, что добавление вориностата может активировать проапоптотические белки BIM и BAX в PC-9GR и В клетках h2650-M3, но не в клетках h2975, терапевтическая стратегия может подавлять антиапоптотический белок Bcl-xL в клетках h2975, но не в клетках PC-9GR и h2650-M3.Более всего было показано, что добавление вориностата активировало антиапоптотический белок Bcl-2 во всех трех вышеупомянутых клеточных линиях. Эти результаты предполагают, что клетки NSCLC с различными механизмами устойчивости к EGFR-TKI показали большую гетерогенность в апоптотическом ответе на HDACi. Согласно соответствующей литературе [14, 38], можно сделать вывод, что одновременное ингибирование Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1 может приводить к значительному увеличению апоптоза, индуцированного вориностатом, в различных типах клеток NSCLC.

Предыдущее исследование показало, что вориностат в комбинации с Bcl-2 и ингибитором Bcl-xL ABT-263 демонстрирует тесное взаимодействие для преодоления неоднородности, связанной с ответом на HDACi в различных типах опухолевых клеток [38]. Однако ABT-263 не проявляет способности ингибировать Mcl-1, который является важным фактором, влияющим на эффект этого лечения. Между тем, на практике применение ингибиторов антиапоптотических белков ограничено из-за их токсичности и высокой цены. Неожиданно оказалось, что метформин является эффективным, экономичным и безопасным лекарством для помощи при раке, которое может повышать клеточную чувствительность к EGFR-TKI [21, 22] и может синергетически усиливать противоопухолевую активность HDACis [39].Что еще более важно, метформин может подавлять экспрессию антиапоптотических белков, таких как Bcl-2 и Mcl-1 [23]. В настоящем исследовании, как и ожидалось, метформин может эффективно преодолевать дефицит вориностата в регуляции антиапоптотических белков Bcl- 2, добавление метформина в низких дозах может значительно ингибировать Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1 и дополнительно повышать уровни экспрессии BIM и BAX, а также синергетически индуцировать апоптоз и повышать чувствительность гефитиниба при этих NSCLC. клетки.Результаты показали, что комбинация вориностата и метформина может формально представлять новую стратегию преодоления устойчивости к EGFR-TKI в различных клетках NSCLC, проявляющих разные механизмы устойчивости. Более того, клиническая доза в этой комбинированной стратегии была намного ниже, чем сообщалось ранее [21, 29]; следовательно, указывается, что эта комбинированная стратегия может отображать ослабленный профиль побочных эффектов, демонстрируя при этом более высокую эффективность.

Сообщается, что проапоптозный белок BIM тесно связан с устойчивостью к EGFR-TKI [40] и является важной мишенью для HDACi [11, 12]. Основываясь на наблюдениях, мы также продемонстрировали, что комбинированное лечение зависит от BIM и то, что подавление экспрессии BIM привело к значительному снижению апоптоза и гибели клеток, которые были вызваны комбинированным лечением.Эти данные продемонстрировали, что повышенные уровни BIM играют важную роль в синергетическом цитотоксическом эффекте вориностата в сочетании с метформином.

Роль аутофагии в лечении рака сложна, и неясно, при каких условиях аутофагия способствует гибели или выживанию клеток. Исследования показали, что ингибирование аутофагии может преодолеть резистентность к эрлотинибу, индуцируя апоптоз и вызывая стресс ER [19], что указывает на необходимость ингибирования аутофагии для усиления эффекта гефитиниба.В этом исследовании мы обнаружили, что и вориностат, и гефитиниб вызывают сильную индукцию аутофагии в клетках h2975 и PC-9GR, которая значительно ингибируется метформином. Затем мы подтвердили синергетический эффект подавления аутофагии в условиях комбинаторного лечения с использованием вориностата, гефитиниба и спаутина-1, показали, что спаутин-1 может значительно повысить уровень экспрессии BIM и индукцию апоптоза при комбинированном применении гефитиниба и вориностата. Эти наблюдения показали, что ингибирование аутофагии, индуцированной гефитинибом и вориностатом, могло сыграть роль в индукции апоптоза, а метформин мог также способствовать эффекту индукции апоптоза путем ингибирования аутофагии.

В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что лечение метформином в сочетании с вориностатом значительно улучшает чувствительность EGFR-TKI в клетках NSCLC, которые проявляют внутреннюю или приобретенную устойчивость к EGFR-TKI, и делает это за счет индукции BIM-зависимого апоптоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и реагенты

Чувствительные к гефитинибу клетки PC-9 (несущие делецию в экзоне 19 EGFR) были подарены профессором Дж. Сюй и доктором М. Лю из Медицинского университета Гуанчжоу. (Китай).Мы создали устойчивые клоны клеток PC-9, постоянно подвергая клетки воздействию возрастающих концентраций гефитиниба, как описано ранее [41]. Концентрация гефитиниба увеличивалась ступенчато (с 0,02 мкМ до 2 мкМ), когда клетки возобновляли пролиферацию, аналогично тому, как это происходит в необработанных родительских клетках. Полученные клетки PC-9GR были устойчивы к гефитинибу in vitro (дополнительная фигура 1). Клетки h2975 были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния, США), которые несут мутации L858R и T790M в гене EGFR и обладают устойчивостью к гефитинибу [42].Клетки h2650-M3 были любезным подарком от доктора Р. Сорделла из лаборатории Колд-Спринг-Харбор, которые несут делецию экзона 19 в рамке считывания (delE746-A750) гена EGFR и гомозиготную делецию PTEN и связаны с гефитинибом. сопротивление [42]. Эти клетки культивировали в среде RPMI-1640 (HyClone), содержащей 10% FBS (Gibco), 2 ммоль / л раствора L-глутамина (Gibco), 100 мкг / мл стрептомицина (HyClone) и 100 Ед / мл пенициллина (HyClone). при 37 ° C в атмосфере с 5% CO2 в воздухе и полностью увлажненном (влажность 90%) инкубаторе.

Гефитиниб (Iressa) был получен от Tocris Bioscience и хранился в виде исходных растворов 10 ммоль / л в диметилсульфоксиде (ДМСО) при -20 ° C. Метформин (Sigma) хранили в виде исходных растворов с концентрацией 1 моль / л в деионизированной воде при -20 ° C. Вориностат (Sigma) и спаутин-1 (Selleck) растворяли в ДМСО и хранили при -20 ° C.

Анализы роста и инвазии клеток

Цитотоксические эффекты гефитиниба плюс вориностат и / или метформин определяли с помощью метода восстановления красителя МТТ и анализа включения BrdU [43].ДИ был рассчитан с помощью программы CompuSyn (ComboSyn, Inc., Парамус, Нью-Джерси, США), принимая 1 в качестве порогового значения. ДИ <1 представляет синергетический эффект, ДИ = 1 представляет эффект привыкания, а ДИ> 1 указывает на антагонистический эффект [44]. Инвазию клеток измеряли с помощью 24-луночных вставок диаметром 6,5 мм (размер пор 8,0 мкм; Corning Incorporated). Относительный индекс клеточной инвазии рассчитывали, как сообщалось ранее [45].

Анализы проточной цитометрии

Апоптоз клеток обнаруживали с помощью анализа проточной цитометрии.Клетки собирали через 48 часов после различных обработок трипсинизацией, затем трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и ресуспендировали при плотности 1 × 107 клеток / мл. После двойного окрашивания с использованием набора I для обнаружения апоптоза FITC Annexin V и PI в течение 30 минут при температуре окружающей среды в темноте клетки анализировали с использованием проточного цитометра (Beckman Coulter Novios, FL, США).

РНК-интерференция

Клетки культивировали в 6-луночных планшетах с 3 × 106 клеток на лунку.Через 24 часа клетки трансфицировали малой интерферирующей РНК (миРНК) против BIM с использованием реагента для трансфекции Hiper-Fect (QIAGEN, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.

Целевые последовательности миРНК были следующими:

  • Отрицательный контроль BIM: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’и 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ‘

    • ‘

  • GIM- # GIMACCU: ‘- UUCAGGAUUACCUUGUGGCdTdT-3’

  • БИМ # 2: 5′-GACGAGUUUAACGCUUACUdTdT-3 ‘и 5′-AGUAAGCGUUAAACUCGUCdTdT -3’

  • БИМ # 3: 5′- GAGACGAGUUUAACGCUUAdTdT-3’and 5′-UAAGCGUUAAACUCGUCUCdTdT- 3 ′ (Г. Э. Дхармакон).Клетки собирали через 48 часов после трансфекции.

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали и лизировали в буфере для лизиса, который был дополнен ингибиторами протеаз и фосфатаз. После 3 мин лизиса остатки клеток удаляли центрифугированием при 12000 × g в течение 30 мин и концентрацию белка определяли методом Брэдфорда (Millipore, Billerica, MA, USA). Затем равные количества белка разделяли с помощью 12% SDS-PAGE и затем переносили на PVDF-мембрану (Millipore, Billerica, MA, USA) с использованием системы сухого блоттинга iBlot ™ (BIO-RAD).Затем, после блокирования мембраны 5% белками обезжиренного молока, мембраны подвергались перекрестной реакции со специфическим антителом при 4 ° ° C в течение ночи (при разведении 1: 1000). Затем мембраны промывали трис-буферным физиологическим раствором / твин-20 (TBST) и инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, в течение 1 часа (при разведении 1: 5000), после чего наблюдали специфические белковые полосы на мембранах с использованием Система обнаружения ECL (BIO-RAD). Первичные антитела и вторичные антитела (конъюгированные с HRP антикроличьи IgG) были получены от Cell Signaling Technology.Контроль равной нагрузки белка оценивали с помощью антитела против β-актина (Bioss).

Обнаружение аутофагии Cyto-ID

Клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 3 × 106 клеток на лунку, а затем обрабатывали только гефитинибом (IC25) или совместно с вориностатом (0,5 мкМ) и / или метформином. (1 мМ) в течение 48 часов. Затем клетки трижды промывали PBS и затем инкубировали в Cyto-ID (1 мкл Cyto-ID / 1 мл PBS) в течение 15 минут в соответствии с инструкциями производителя (Cyto-ID® Autophagy Detection Kit, ENZ-51031-K200 , ENZO, Фармингдейл, Нью-Йорк, США).Затем клетки дважды промывали PBS и наблюдали с помощью конфокальной микроскопии.

Просвечивающая электронная микроскопия

Образцы клеток фиксировали в течение ночи в 2% глутаровом альдегиде и при 4 ° C и промывали в 0,05 какодилатном буфере натрия, после фиксации в 1% тетроксиде осмия, дегидратировали в этаноле и пропиленоксиде. Были приготовлены ультратонкие срезы, собраны на медных сетках, окрашены цитратом свинца и 0,5% уранилацетатом и исследованы с помощью ТЕМ (Philips TECNAI 10), установленного в Центре биомедицинского анализа Третьего военного медицинского университета.Аутофагия клеток была определена количественно путем измерения объема, занимаемого аутофагическими структурами, в соответствии с рекомендациями [46].

Пациенты и образцы

Образцы были собраны у пациентов с распространенным НМРЛ и активирующими мутациями EGFR, все пациенты уже принимали гефитиниб в качестве лечения первой линии в период с января 2013 г. по декабрь 2015 г. в госпитале Дапинг Третьего военно-медицинского университета (Чунцин, Китай). ). Все слайды срезов ткани запекали при 60 ° C в течение 2 часов, затем депарафинизировали, гидратировали и инкубировали с 3% перекисью водорода.После обработки в микроволновой печи в 0,01 М цитратном буфере натрия в течение 30 минут срезы предварительно инкубировали в 10% нормальной козьей сыворотке в течение 30 минут для предотвращения неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубировали с поликлональным антителом BIM в течение ночи при 4 ° C. Затем срезы последовательно инкубировали с биотинилированным вторичным антителом козы против кролика (Dako, Glostrup, Дания) в течение 30 минут каждое при комнатной температуре. Результаты иммуноокрашивания были независимо подтверждены двумя опытными патологами, не знавшими личности пациента и его клинического статуса.Оценка окрашивания ИГХ была основана на критериях, описанных ранее [47]. Исследование было одобрено этическим комитетом госпиталя Дапинг Третьего военно-медицинского университета. Информированное согласие было получено от всех отдельных пациентов или родственников, включенных в исследование.

Статистический анализ

Все данные были выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего для трех образцов и проанализированы с использованием t-критерия Стьюдента. Статистический анализ проводился с использованием пакета статистических программ SPSS v.17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Статистическая значимость была принята при значении альфа P <0,05.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ЧЕРТЕЖИ И ТАБЛИЦА

Аббревиатуры

EGFR-TKI Ингибитор тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста
HDACi 33 гистон-деацецероз 90-333
Bcl-2 B-клеточная лимфома 2
CI комбинированный индекс
PFS выживаемость без прогрессирования 9033 9033 9033 9033 9033 9033 9033 9033 9033 9033 9033 9033 PEM

 солевой раствор с фосфатным буфером
PI йодид пропидия
siRNA малая интерферирующая РНК
TBST TRIS-солевой буфер

0

Вклад авторов 90 003 Рукопись написана при участии всех авторов, и все авторы рецензировали рукопись.

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ

О потенциальных конфликтах интересов не сообщалось.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81472189 и 81672284).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Шиен К., Тойока С., Ямамото Х., Сох Дж., Джида М., Тху К.Л., Хашида С., Маки Й., Итихара Е., Асано Х., Цукуда К., Такигава Н., Киура К. и др. Приобретенная устойчивость к ингибиторам EGFR связана с проявлением в раковых клетках свойств, подобных стволовым клеткам.Cancer Res. 2013; 73: 3051–3061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 2. Cross DA, Ashton SE, Ghiorghiu S, Eberlein C, Nebhan CA, Spitzler PJ, Orme JP, Finlay MR, Ward RA, Mellor MJ, Hughes G, Rahi A, Jacobs VN, et al. AZD9291, необратимый TKI EGFR, преодолевает опосредованную T790M устойчивость к ингибиторам EGFR при раке легких. Рак Discov. 2014; 4: 1046–1061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Steuer CE, Khuri FR, Ramalingam SS. Следующее поколение ингибиторов тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста в лечении рака легких.Рак. 2015; 121: E1–6. [PubMed] [Google Scholar] 4. Shi P, Oh YT, Zhang G, Yao W., Yue P, Li Y, Kanteti R, Riehm J, Salgia R, Owonikoko TK, Ramalingam SS, Chen M, Sun SY. Амплификация гена Met и гиперактивация белка являются механизмом устойчивости к ингибиторам EGFR первого и третьего поколения при лечении рака легких. Cancer Lett. 2016; 380: 494–504. [PubMed] [Google Scholar] 5. Wang S, Tsui ST, Liu C, Song Y, Liu D. Мутация EGFR C797S опосредует устойчивость к ингибиторам третьего поколения при T790M-положительном немелкоклеточном раке легкого.J Hematol Oncol. 2016; 9:59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Коста К., Молина М.А., Дроздовский А., Хименес-Капитан А., Бертран-Аламилло Дж., Карачалиу Н., Жерве Р., Массути Б., Вей Дж., Моран Т., Маджем М., Фелип Е., Карсерени Е. и др. Влияние мутаций EGFR T790M и экспрессии мРНК BIM на исход у пациентов с EGFR-мутантным НМРЛ, получавших эрлотиниб или химиотерапию, в рандомизированном исследовании III фазы EURTAC. Clin Cancer Res. 2014; 20: 2001–2010. [PubMed] [Google Scholar] 7. Коста ДБ, Халмос Б., Кумар А., Шумер С.Т., Хуберман М.С., Боггон Т.Дж., Тенен Д.Г., Кобаяши С.BIM опосредует индуцированный ингибитором тирозинкиназы EGFR апоптоз при раке легких с онкогенными мутациями EGFR. PLoS Med. 2007; 4: 1669–1679. обсуждение 1680. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Джин Хо, Ли Й.Х., Пак Дж.А., Ким Дж.Х., Хонг С.Е., Ким Х.А., Ким Е.К., Но В.К., Ким Б.Х., Йе СК, Чанг Й.Х., Хонг С.И., Хонг Й.Дж. и др. Блокирование Stat3 увеличивает чувствительность клеток NSCLC к ингибированию PI3K / mTOR. Biochem Biophys Res Commun. 2014; 444: 502–508. [PubMed] [Google Scholar] 9. Вильянуэва MT. Генетика: устойчивость к TKI: поиск трещины в BIM.Нат Рев Клин Онкол. 2012; 9: 247. [PubMed] [Google Scholar] 10. Nakagawa T, Takeuchi S, Yamada T, Ebi H, Sano T, Nanjo S, Ishikawa D, Sato M, Hasegawa Y, Sekido Y, Yano S. Устойчивость к EGFR-TKI из-за полиморфизма BIM можно обойти в сочетании с ингибированием HDAC. Cancer Res. 2013; 73: 2428–2434. [PubMed] [Google Scholar] 11. Боты М., Джонстон RW. Рациональные комбинации с использованием ингибиторов HDAC. Clin Cancer Res. 2009; 15: 3970–3977. [PubMed] [Google Scholar] 12. Xargay-Torrent S, López-Guerra M, Saborit-Villarroya I, Rosich L, Campo E, Roué G.Индуцированный вориностатом апоптоз в лимфоме из клеток мантии опосредуется ацетилированием проапоптотических промоторов гена Bh4. Clin Cancer Res. 2011; 17: 3956–3968. [PubMed] [Google Scholar] 13. Witta SE, Jotte RM, Konduri K, Neubauer MA, Spira AI, Ruxer RL, Varella-Garcia M, Bunn PA, Jr, Hirsch FR. Рандомизированное исследование фазы II эрлотиниба с энтиностатом и без него у пациентов с далеко зашедшим немелкоклеточным раком легкого, которые прогрессировали на предшествующей химиотерапии. J Clin Oncol. 2012; 30: 2248–2255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14.Томпсон Р.К., Вардиногианнис I, Гилмор Т.Д. Чувствительность линий диффузных крупных клеток B-клеточной лимфомы к апоптозу, индуцированному ингибитором гистондеацетилазы, модулируется активностью белка семейства BCL-2. PLoS One. 2013; 8: e62822. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 15. Zou M, Xia S, Zhuang L, Han N, Chu Q, Chao T, Peng P, Chen Y, Gui Q, Yu S. Нокдаун гена Bcl-2 увеличивает чувствительность к ингибиторам тирозинкиназы EGFR в клетке рака легкого h2975 линия, несущая мутацию T790M. Int J Oncol.2013; 42: 2094–2102. [PubMed] [Google Scholar] 16. Уитсетт Т.Г., Мэтьюз И.Т., Кардоне М.Х., Лена Р.Дж., Пирсил В.Е., Биттнер М., Сима С., Лобелло Дж., Вайс Г.Дж., Тран Н.Л. Mcl-1 опосредует TWEAK / Fn14-индуцированное выживание при немелкоклеточном раке легкого и терапевтический ответ. Mol Cancer Res. 2014; 12: 550–559. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Chen S, Zhang Y, Zhou L, Ленг Y, Lin H, Kmieciak M, Pei XY, Jones R, Orlowski RZ, Dai Y, Grant S. Стратегия BIM-таргетинга преодолевает адаптивную резистентность к бортезомибу при миеломе за счет новой связи между аутофагией и апоптоз.Кровь. 2014; 124: 2687–2697. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Коенеке Э., Витт О., Эхме И. Члены семьи HDAC переплетены в регуляции аутофагии: лекарственная уязвимость в агрессивных опухолевых образованиях. Ячейки. 2015; 4: 135–168. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19. Wang Z, Du T, Dong X, Li Z, Wu G, Zhang R. Ингибирование аутофагии способствует цитотоксичности эрлотиниба в клетках рака легких за счет модуляции стресса эндоплазматического ретикулума. Int J Oncol. 2016; 48: 2558–2566. [PubMed] [Google Scholar] 20.Birsoy K, Possemato R, Lorbeer FK, Bayraktar EC, Thiru P, Yucel B, Wang T, Chen WW, Clish CB, Sabatini DM. Метаболические детерминанты чувствительности раковых клеток к ограничению глюкозы и бигуанидам. Природа. 2014; 508: 108–112. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21. Li L, Han R, Xiao H, Lin C, Wang Y, Liu H, Li K, Chen H, Sun F, Yang Z, Jiang J, He Y. Метформин сенсибилизирует EGFR-TKI-устойчивые клетки рака легких человека in vitro и in vivo посредством ингибирования передачи сигналов IL-6 и реверсирования EMT.Clin Cancer Res. 2014; 20: 2714–2726. [PubMed] [Google Scholar] 22. Chen H, Yao W, Chu Q, Han R, Wang Y, Sun J, Wang D, Wang Y, Cao M, He Y. Синергетические эффекты метформина в сочетании с EGFR-TKI при лечении пациентов с развитой немалой клеточный рак легкого и диабет 2 типа. Cancer Lett. 2015; 369: 97–102. [PubMed] [Google Scholar] 24. Luo H, Yang Y, Duan J, Wu P, Jiang Q, Xu C. Регулируемая PTEN передача сигналов AKT / FoxO3a / Bim способствует апоптозу, опосредованному реактивными формами кислорода, в клетках колоректального рака, обработанных селенитом.Cell Death Dis. 2013; 4: e481. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Дауган М., Дюфа Войчицки А., Д’Хайер Б., Буди В. Метформин: антидиабетический препарат для борьбы с раком. Pharmacol Res. 2016; 113: 675–685. [PubMed] [Google Scholar] 26. Wu DW, Chen CY, Chu CL, Lee H. Паксиллин придает устойчивость к ингибиторам тирозинкиназы при EGFR-мутантном раке легких посредством модуляции стабильности белков BIM и Mcl-1. Онкоген. 2016; 35: 621–630. [PubMed] [Google Scholar] 27. Петиньи-Лечартье С., Дубок С., Джебахи А., Луи М.Х., Абейлар Э., Денойэль С., Годюшон П., Пулен Л., Вильдье М.Ингибитор mTORC1 / 2 AZD8055 усиливает эффективность ингибитора MEK траметиниба для снижения соотношения Mcl-1 / [Bim and Puma] и сенсибилизации клеток карциномы яичников к ABT-737. Mol Cancer Ther. 2017; 16: 102–115. [PubMed] [Google Scholar] 28. Sugita S, Ito K, Yamashiro Y, Moriya S, Che XF, Yokoyama T, Hiramoto M, Miyazawa K. EGFR-независимая индукция аутофагии с помощью гефитиниба и усиление его цитотоксического эффекта путем нацеливания на аутофагию с помощью кларитромицина в немелкоклеточных клетках рака легких .Biochem Biophys Res Commun. 2015; 461: 28–34. [PubMed] [Google Scholar] 29. Ли Т.Г., Чжон Э., Ким СИ, Ким Х.Р., Ким Ч. Комбинация необратимых TKI EGFR и SAHA индуцирует апоптоз и опосредованную аутофагией гибель клеток для преодоления приобретенной устойчивости при раке легкого с мутацией EGFR T790M. Int J Cancer. 2015; 136: 2717–2729. [PubMed] [Google Scholar] 30. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T., Yamamoto A, Kirisako T., Noda T., Kominami E, Ohsumi Y, Yoshimori T. LC3, гомолог дрожжевого Apg8p у млекопитающих, после обработки локализуется в мембранах аутофагосом.EMBO J. 2000; 19: 5720–5728. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Jarauta V, Jaime P, Gonzalo O, de Miguel D, Ramírez-Labrada A, Martínez-Lostao L, Anel A, Pardo J, Marzo I, Naval J. Ингибирование аутофагии с помощью хлорохина потенцирует индуцированный карфилзомибом апоптоз в клетках миеломы в vitro и in vivo . Cancer Lett. 2016; 382: 1–10. [PubMed] [Google Scholar] 32. Zhu Y, He W, Gao X, Li B, Mei C, Xu R, Chen H. Ресвератрол преодолевает резистентность к гефитинибу за счет увеличения внутриклеточной концентрации гефитиниба и запуска апоптоза, аутофагии и старения в клетках PC9 / G NSCLC.Научный доклад 2015; 5: 17730. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Лю Д., Ян Ю., Чжао С. Аутофагия способствует приобретенной EGFR-TKI устойчивости немелкоклеточных клеток рака легкого. J Formos Med Assoc. 2014; 113: 141–142. [PubMed] [Google Scholar] 34. Кувано М., Сонода К., Мураками Ю., Ватари К., Оно М. Преодоление лекарственной устойчивости к ингибиторам рецепторной тирозинкиназы: уроки рака легких. Pharmacol Ther. 2016; 161: 97–110. [PubMed] [Google Scholar] 35. Дель Буфало Д., Дезидери М., Де Лука Т., Ди Мартиле М., Габеллини К., Моника В., Буссо С., Эрамо А., Де Мария Р., Милелла М., Тришуоглио Д.Ингибирование гистон-деацетилазы синергетически усиливает цитотоксичность пеметрекседа за счет индукции апоптоза и аутофагии при немелкоклеточном раке легкого. Молочный рак. 2014; 13: 230. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Греве Г., Шиффманн И., Пфайфер Д., Пантик М., Шулер Дж., Любберт М. Ингибитор пан-HDAC панобиностат действует как сенсибилизатор активности эрлотиниба в клетках немелкоклеточного рака легкого с мутацией EGFR и дикого типа. BMC Рак. 2015; 15: 947. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37.Болден Дж. Э., Пирт М. Дж., Джонстон Р. В.. Противораковая активность ингибиторов гистондеацетилазы. Nat Rev Drug Discov. 2006; 5: 769–784. [PubMed] [Google Scholar] 38. Chüeh AC, Tse JW, Dickinson M, Ioannidis P, Jenkins L, Tögel L, Tan B, Luk I, Dávalos-Salas M, Nightingale R, Thompson MR, Williams BR, Lessene G, et al. Репрессия BCL-XL ATF3 определяет апоптотическую чувствительность к ингибиторам HDAC для разных типов опухолей. Clin Cancer Res. 2017; 23: 5573–5584. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Duo J, Ma Y, Wang G, Han X, Zhang C.Метформин синергетически усиливает противоопухолевую активность ингибитора гистондеацетилазы трихостатина А против линии клеток остеосаркомы. ДНК Cell Biol. 2013. 32: 156–164. [PubMed] [Google Scholar] 40. Li H, Zhou S, Li X, Wang D, Wang Y, Zhou C, Schmid-Bindert G. Устойчивость к гефитинибу связана с экспрессией BIM в клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого. Биотерма для рака Радиофарм. 2013; 28: 115–123. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 41. Энгельман Дж. А., Зейнуллаху К., Мицудоми Т., Сонг Й., Хайленд С., Пак Дж. О., Линдеман Н., Гейл С. М., Чжао Х, Кристенсен Дж., Косака Т., Холмс А. Дж., Роджерс А. М. и др.Амплификация МЕТ приводит к устойчивости к гефитинибу при раке легких за счет активации передачи сигналов ERBB3. Наука. 2007; 316: 1039–1043. [PubMed] [Google Scholar] 42. Пао В., Миллер В.А., Полити К.А., Рили Г.Дж., Сомвар Р., Заковски М.Ф., Крис М.Г., Вармус Х. Приобретенная устойчивость аденокарцином легких к гефитинибу или эрлотинибу связана со второй мутацией в киназном домене EGFR. PLoS Med. 2005; 2: e73. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 43. Yao Z, Fenoglio S, Gao DC, Camiolo M, Stiles B, Lindsted T, Schlederer M, Johns C, Altorki N, Mittal V, Kenner L, Sordella R.TGF-b Ось IL-6 опосредует селективные и адаптивные механизмы устойчивости к молекулярной таргетной терапии при раке легкого. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2010; 107: 15535–15540. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Чоу Т.К., Мартин Н. CompuSyn для комбинаций лекарств: программное обеспечение для ПК и руководство пользователя: компьютерная программа для количественной оценки синергизма и антагонизма в комбинациях лекарств и определения значений IC50, ED50 и LD50. ComboSyn Inc; Парамус, (Нью-Джерси): 2005. [Google Scholar] 45. Сюй X, Fan Z, Kang L, Han J, Jiang C, Zheng X, Zhu Z, Jiao H, Lin J, Jiang K, Ding L, Zhang H, Cheng L и др.Белок X вируса гепатита B репрессирует miRNA-148a для усиления туморогенеза. J Clin Invest. 2013; 123: 630–645. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 46. Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K, Agholme L, Agnello M, Agostinis P, Aguirre-Ghiso JA, Ahn HJ, Ait-Mohamed O, Ait-Si-Ali S., et al. Рекомендации по использованию и интерпретации анализов для мониторинга аутофагии. Аутофагия. 2012; 8: 445–544. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Bim избегает вытеснения Bh4-миметическими противораковыми препаратами, запирая Bcl-XL и Bcl-2

двумя болтами

Резюме:

Рукопись Эндрюса и его коллег применяет серию сложных анализов мониторинга взаимодействия внутриклеточных белков с соответствующими биохимическими исследованиями для оценки чувствительности комплексов только Bh4 / антиапоптоз к фармакологической диссоциации низкомолекулярными ингибиторами.Вывод заключается в том, что комплексы с участием BIM более сильны из-за ранее недооцененного вторичного интерфейса связывания между C-концом BIM и антиапоптотическим Bcl-XL / Bcl-2. Хотя некоторые данные не так однозначны, как выраженные интерпретации, общие концепции достаточно хорошо продемонстрированы, и возможность проводить такие исследования на живых клетках, чтобы лучше проверять состояние этих релевантных с медицинской точки зрения взаимодействий, безусловно, ценится.

Мы высоко ценим положительные комментарии рецензентов и внесенные продуманные и конструктивные идеи / предложения.В ответ мы попытались рассмотреть каждый из них как можно более тщательно. В результате не только эта рукопись была значительно улучшена за счет добавления новых функциональных данных, но и внесен ряд дополнительных изменений, которые улучшают ясность способа представления данных.

На рис. 3, рис. 5 и рис. 2 — дополнение к рисунку 3 представлены новые данные. Дополнительные изображения, показывающие, что морфологические изменения не влияют на наши результаты, были добавлены в ответ на запрос рецензента.Чтобы подтвердить, что подобный диапазон морфологий присутствует во всех данных, репрезентативные изображения данных FLIM-FRET также были добавлены к рисункам 1, 2 и приложениям к рисунку 2. Данные совместной локализации на рисунке 7C были заменены новыми данными и анализом с конвейером Cell Profiler, чтобы обеспечить анализ большего количества изображений.

Для улучшения представления и использования преимуществ формата eLife некоторые рисунки были разделены (например, исходный рисунок 1 теперь является рисунками 1 и 2), а дополнения рисунков к рисункам 2 и 9 были разбиты на отдельные дополнения.В разделе методов то, что ранее называлось «Измерение жизнеспособности клеток и мембранного потенциала», было заменено «Анализом гибели клеток на основе изображений», потому что измерения мембранного потенциала, сделанные ранее, были заменены анализами с использованием проверенного обученного линейного классификатора, который объединяет клетки и морфология ядра и данные TMRE для классификации клеток как живых или мертвых / умирающих.

Чтобы устранить функциональные последствия в живых клетках нового сайта связывания, который мы обнаружили в Bim, мы даем лучшее описание исходных данных и загрузили новую статью Chi et al., озаглавленный «Карбоксиконцевая последовательность Bim делает возможной активацию Bax и уничтожение непраймированных клеток», которую мы представили для потенциальной совместной или связанной публикации.

Чтобы создать более удобную для просмотра версию необходимого сравнения между оригинальной и повторно представленной рукописью, рисунки были удалены из предыдущей версии перед генерацией сравнения.

Наконец, скрипты программного обеспечения были загружены на Github, включая описание на основе Powerpoint для анализа колокализации.

Существенные изменения:

1) Авторы должны продемонстрировать функциональную связь между наблюдаемыми различиями в диссоциации белковых комплексов и фенотипическим результатом (т.е. апоптотической гибелью клеток). Рекомендуемое трио лечения — это ABT-263 (двойной ингибитор), селективный ингибитор Bcl-XL и, что важно, селективный ингибитор Bcl-2 ABT-199. Последний агент является наиболее клинически значимым (единственный препарат, одобренный FDA) и должен быть включен в исследование.Два селективных ингибитора также могут служить идеальным контролем друг для друга и лучше проверять специфичность этой системы взаимодействия белков живых клеток.

2) Авторам необходимо продемонстрировать функциональную значимость концепции связывания замка с двойным засовом в ячейках. Хотя авторы указывают, что механизм блокировки с двумя засовами имеет «серьезные последствия для использования Bh4-миметиков в качестве лекарств», в рукописи отсутствуют эксперименты, подтверждающие этот вывод. Непосредственным экспериментом для решения этого ключевого момента может быть временная экспрессия и сравнение влияния мутанта Bh4 дикого типа и мутанта CTS (например,г. мутация потери функции L185), и двойной мутант по индукции апоптоза / гибели клеток и относительной устойчивости к антиапоптотическим ингибиторам.

Хотя мы согласны с рецензентом в том, что такого рода данные будут представлять значительный интерес, рассмотрение этого вопроса намного сложнее, чем кажется. Результат, предсказанный для точки 1, можно увидеть на рисунке 1, на котором в присутствии ABT-263 клетки MCF-7, сверхэкспрессирующие Bcl-XL, допускают более высокие относительные уровни экспрессии BimEL, чем у Bad или tBid (усечение на голубых кривых). .В новой версии мы дополнительно уточнили это в тексте. Однако по причинам, изложенным ниже, это трудно определить количественно, и из-за капризов временной трансфекции не очевидно во всех данных в рукописи. Три эксперимента, показанные на рисунке 1, служили контролем для многих других экспериментов и повторялись много раз, поэтому мы очень уверены в нашей интерпретации этих данных. Как подробно описано в пункте 3, ABT-199 представляет собой флуоресцентный анализ FLIM FRET, предотвращающий флуоресценцию (теперь это указано в подразделе «Влияние мутаций последовательности Bh4 и низкомолекулярных ингибиторов на взаимодействия между антиапоптотическими белками и только Bh4 pro -апоптотические белки », пятый абзац).Тем не менее, функциональные данные, добавленные для venetoclax на новом рисунке 3D, предполагают, что основным ингибитором апоптоза в клетках MCF-7 является MCL-1 (рисунок 3D-E), что затрудняет использование venetoclax для демонстрации непосредственной значимости замка с двойным засовом в живых организмах. клетки.

Поскольку это важный вопрос, мы также добавили данные, чтобы уточнить функциональные отношения к нескольким цифрам. Основная идея состоит в том, что BimEL должен быть более активным, чем BimEL-dCTS, чтобы ингибировать Bcl-XL и Bc-2, поскольку у последнего отсутствует второй сайт связывания.Однако BimEL-dCTS эффективно ингибирует MCL-1, а клетки MCF7, используемые во всех наших экспериментах, сильно зависят от MCL-1 для выживания (новый рисунок 3E). Действительно, теперь мы показываем, что единственным ингибитором, который эффективно убивал клетки MCF-7, был ингибитор MCL-1. Ингибиторы Bcl-2 и / или Bcl-XL приводили к минимальному уничтожению, которое полностью подавлялось экспрессией экзогенного Bcl-XL или Bcl-2 (новая фигура 3D-E). Таким образом, хотя мы продемонстрировали, что конструкции C Bcl-XL и C Bcl-2 защищают от TNFα и циклогексимида (хорошо известно, что они вызывают апоптоз), защита, обеспечиваемая обоими антиапоптотическими белками, эквивалентна в ответ на экспрессию BimEL и BimEL-dCTS (новый рисунок 5A).Этот результат частично объясняется индукцией гибели клеток из-за связывания Bim-Bh4 с MCL-1 (новый рисунок 3E). Чтобы обойти эту проблему, мы заменили область Bh4 в Bim и Bim-dCTS на область Bad. Эти гибридные молекулы сохраняют эффективное связывание с Bcl-XL и Bcl-2, но больше не связывают Mcl-1. Когда гибридные белки экспрессируются в клетках MCF-7, полноразмерный белок теперь более эффективен в уничтожении клеток MCF-7, чем версия без CTS (новый рисунок 5B), как предсказывали авторы обзора.Эти новые результаты представлены в подразделе, озаглавленном «CTS Bim способствует проапоптотической активности». Однако, как описано, результаты усложняются, потому что CTS Bim не только увеличивает сродство Bim к Bcl-XL и Bcl-2, но и позволяет Bim эффективно активировать Bax. Эта функция Bim CTS рассматривается в клеточных линиях и первичных клетках, а молекулярный механизм описан в нашей новой статье Chi et al. которые мы отправили для совместной публикации.

Таким образом, единственный способ устранить биологические эффекты делеции CTS напрямую — это использовать очищенные белки.Поэтому мы также добавили данные, показывающие, что при инкубации с делецией митохондрий Bim CTS снижает сродство к связыванию с Bcl-XL (новый рисунок 5C). Однако, как мы отмечаем, измеренная аффинность значительно ниже уровня экспрессии в клетках. В результате можно было бы ожидать, что даже при эндогенных уровнях Bim, BimEL-dCTS будет связывать и ингибировать Bcl-XL в клетках. Кроме того, мы показываем, что без CTS Bim менее эффективен при замещении tBid и активированном Bax из Bcl-XL (новый рисунок 5D-E).Следовательно, биологический результат высвобождения или невыпуска Bim из Bcl-2 и Bcl-XL в клетках дополнительно осложняется как активностью антиапоптотического белка, так и функциями его партнеров по связыванию, включая высвобожденный белок.

Те же осложнения существуют для мутантов, различающихся по устойчивости к ингибиторам Bcl-XL и Bcl-2. Мутации, которые снижают сродство связывания с Bcl-XL, приводят к потере активации Bax, и поэтому полученные данные трудно интерпретировать.В новой совместно представленной рукописи Chi et al. мы исследуем эффекты нового сайта связывания в Bim в нескольких линиях клеток, как это было предложено рецензентом. Мы обнаружили, что различная зависимость разных клеточных линий от различных антиапоптотических белков по сравнению с восприимчивостью к активации Bax означает, что результаты такого рода экспериментов в настоящее время непредсказуемы. Действительно, в прилагаемой новой рукописи мы заявляем, что реакция первичных кортикальных нейронов изменяется со временем в культуре (Chi et al.). Именно по этим причинам мы были осторожны в тексте этой статьи, чтобы всегда утверждать, что главное следствие второго сайта связывания в Bim, которое мы характеризуем, состоит в том, что эффекты, которые могут быть получены с помощью низкомолекулярных Bh4-миметиков, непредсказуемы. Теперь мы повторили это утверждение в Обсуждении и считаем, что данные, представленные в двух документах, более чем адекватно это демонстрируют.

Повышает ли устранение компонента CTS связывания BimEL чувствительность к антиапоптотическим ингибиторам Bcl-2 и Bcl-XL, как следует из заголовка / статьи?

Название статьи указывает только на то, что второй сайт связывания позволяет Bim не вытесняться с Bcl-XL и Bcl-2 в раковых клетках.Мы показываем, что связывание устойчиво к обоим белкам для основных ингибиторов мультидоменных антиапоптотических белков Bcl-XL и Bcl-2 и что мутанты Bim CTS вытесняются лекарствами в живых клетках. Единственным исключением является ABT-199 (Venetoclax), который, как правильно отмечают обозреватели, является единственным ингибитором, применяемым в клинической практике. Хотя ABT-263 проходит клинические испытания на людях, ABT-199 представляет очевидный интерес и важность, и мы попытались измерить влияние ABT-199 на вытеснение белков Bh4 из Bcl-2 с помощью FLIM-FRET.Сложность в том, что ABT-199 флуоресцентный. Теперь об этом говорится в пятом абзаце подраздела «Влияние мутаций последовательности Bh4 и низкомолекулярных ингибиторов на взаимодействия между антиапоптотическими белками и проапоптотическими белками только Bh4». Более того, флуоресценция ABT-199 является спектрально широкой, и он может подвергаться FRET с mCer3, меченным Bcl-2 (см. Данные ниже). В результате белки Bcl-2, не связанные с белком Bh4, связывают ABT-199, и происходит соответствующее изменение времени жизни донора из-за связывания с лекарством.Поскольку нам нужно подобрать кривую связывания, чтобы однозначно отличить столкновения от аутентичного связывания, нам необходимо измерить FLIM при субнасыщающих концентрациях акцепторного Bh4-белка. По мере уменьшения количества Bh4-белка (низкое соотношение венеры и лазурного) FRET между ABT-199 и Bcl-2 увеличивается. Подбор тройной экспоненциальной модели разрушает анализ, о котором сообщают другие (Garcia et al., 2007; Sun et al., 2011), и в проведенных экспериментах мы получили кривые кажущейся доза-ответ для ABT-199 «смещения» белков Bh4. это не имело смысла и совсем не соответствовало уравнению Хилла.К сожалению, это означает, что FLIM FRET бесполезен для измерения эффектов ABT-199. Чтобы обойти эту проблему, мы пытались сгенерировать далекую красную пару флуоресцентных белков для использования FLIM, но на сегодняшний день время жизни флуоресценции донорных белков слишком мало для надежных измерений связывания (Canty et al., 2018).

ABT199 существенно влияет на срок службы

C Bcl2.

Клетки

BMKd3, экспрессирующие C Bcl2, инкубировали 24 часа только в среде DMEM (необработанной) или в среде с ДМСО, ABT199 или ABT263. Данные FLIM были собраны на ISS-Alba, каждая точка представляет собой среднее время жизни 10 изображений, собранных на реплику (n = 3). Односторонний тест ANOVA выполняли в GraphPad Prism с последующим тестом множественного сравнения Даннета для сравнения с необработанным контролем (*** — значение p <0,0001).

Как описано выше, устранение CTS или введение точечных мутаций в CTS имеет непредсказуемые последствия для клеток, независимо от того, лечили ли они лекарство или нет, в зависимости от степени, в которой изменяется ингибирование не только Bcl-2 и Bcl-XL, но также Mcl-1 и активация жизнеспособности клеток воздействия Bax.Проблема дополнительно осложняется различиями в степени загрузки Bcl-2 и Bcl-XL в клеточных линиях. Таким образом, единственный способ решить этот интересный вопрос — это in vitro с использованием очищенных белков. Данные, демонстрирующие, что мутации в BimCTS увеличивают чувствительность к ABT-263 in vitro, были включены в исходную рукопись (новый рисунок 7D-E). Таким образом, мы установили на живых клетках, что дополнительный сайт связывания в Bim, который мы обнаружили, может иметь значительные, но непредсказуемые эффекты на чувствительность и устойчивость клеток к различным проапоптотическим стимулам.

Каков относительный функциональный вклад компонентов связывания Bh4 и CTS?

Это еще один отличный вопрос. В прилагаемой новой рукописи (представленной Chi et al.) Мы количественно измерили вклад компонентов связывания Bh4 и CTS в Bax и Bcl-XL и сообщили об изменениях Kd, связанных с каждым из них для связывания с Bax. Мы не можем измерить изменения сродства к Bcl-XL, потому что все сродства настолько высоки, что Kds меньше 1 нМ.Таким образом, Kds для связывания Bcl-XL настолько низки, что мутации в CTS не будут влиять на связывание с Bcl-XL биологически релевантным образом, если только не будет добавлен миметик Bh4 или другой белок Bh4 не будет конкурировать за связывание. (новый рисунок 3C-E). Более того, как показано в новой рукописи (представленной Chi et al.), Мы демонстрируем, что при физиологических концентрациях в клетках ОБА последовательности Bh4 и CTS необходимы BimEL для активации Bax. Как было предсказано на основании измерений Kd, одной области Bh4 достаточно для ингибирования Bcl-XL, Bcl-2 и MCl — 1 в нескольких живых клетках.Следовательно, Bim-dCTS убивает клетки, которые «примированы», т.е. зависят от экспрессии антиапоптотических белков, поскольку он может связывать и ингибировать все антиапоптотические белки. Но для уничтожения «незапраймированных» клеток требуется полноразмерный Bim, включая CTS (Chi et al.).

3) Измерение высвобождения катионных липофильных красителей во многих случаях не отражает MOMP или гибель клеток. Например, культивируемые клетки могут выживать в присутствии протонофоров в течение нескольких дней в культуре. Оценивалась ли гибель клеток с помощью других измерений?

Мы согласны с авторами обзора в том, что высвобождения катионных липофильных красителей не всегда достаточно для вывода MOMP или гибели клеток.Однако, когда потеря митохондриального трансмембранного потенциала является результатом активации Bax или Bak (как в экспериментах, описанных здесь), клетки не восстанавливаются и в конечном итоге умирают. Тем не менее, высвобождение катионных липофильных красителей — не самый точный способ измерения приближающейся гибели клеток. По этой причине мы заменили потерю TMRE оценкой клеточной гибели, основанной на многопараметрическом линейном классификаторе, основанном на ядерной конденсации, сокращении клеток и потере окрашивания TMRE (описанном в первом абзаце подраздела «Регулирование апоптоза флуоресцентными гибридными белками в живые клетки »и рис. 3А).Классификатор был обучен на клетках, обработанных TNFα и циклогексимидом, хорошо известным методом индукции апоптоза. Поскольку все три события являются общими для клеток, подвергающихся апоптозу, мы считаем, что разумно сделать вывод, что классификатор идентифицирует клетки, которые претерпели или подвергаются апоптозу. Мы подробно объяснили этот процесс в материалах и методах и даем ссылки на использование этого подхода с клетками MCF-7, другими клеточными линиями и первичными клетками. Наш опыт показывает, что любая клетка, классифицированная как мертвая с помощью этого анализа, обречена на смерть и не выживет, даже если стимул к смерти будет удален.Чувствительность обнаружения апоптоза была улучшена с использованием этого подхода, как видно из данных новых анализов гибели клеток, представленных на новых рисунках 3 и 5.

4) Рисунок 4 — дополнение к рисунку 1, рисунок 7 — дополнение к рисунку 1, рисунок 6 — дополнение к рисунку 1 и рисунок 9 — дополнение к рисунку 2: для различных кривых черный / синий / красный / зеленый неясно, почему конечные точки переменная (относительно оси x). Например, непонятно, почему иногда кривые заканчиваются на <1,0 по оси x (как в столбце Bcl-2 на рисунке 6 - дополнение к рисунку 3J-L), а в других случаях - нет (столбец Bcl-XL на рисунке 6 - приложение к рисунку 1D-F).Это изменение происходит как внутри отдельной субпанели, так и между наборами данных. Если это связано с гибелью клеток из-за временной экспрессии белка Bh4 и лечения лекарствами, как такие различия в индукции гибели клеток в различных условиях влияют на анализ?

Количество каждого акцепторного белка, производимого клетками, варьируется. Несмотря на то, что мы трансфицировали с одинаковым соотношением ДНК к реагенту, количество продуцируемого белка варьируется от конструкции к конструкции и между трансфекциями.Мы предполагаем, что количество генерируемого флуоресцентного мутантного белка зависит от многих факторов, включая размер белка, скорость сворачивания, скорость деградации и убивает ли этот белок (или белок + обработка) клетку. Как указано в оригинальной рукописи, одним из диагностических признаков токсичности, приводящим к более низким уровням интенсивности (переменные конечные точки), является то, что контрольные кривые будут расширяться до более высоких соотношений венеры и лазурного (mCer3), чем при добавлении ABT-263. Эти данные остаются на рисунке 1, где мы показываем, что в присутствии ABT-263 клетка будет терпеть производство большего количества Bim, чем tBid или Bad.Хотя заманчиво приписать это двойному болтовому замку, предотвращающему смещение BimEL (в ответ на вопросы 1-2 выше), описанные выше сложности не позволяют нам сделать это.

Поднятый вопрос о том, как различия в индукции клеточной смерти влияют на анализ, является правильным. Мы приносим свои извинения за то, что не совсем ясно изложили наши явные элементы управления в исходной версии рукописи. Мы заявили только, что мы использовали минимальный и максимальный порог на канале mCer3 (донор) перед бинингом и построением этих кривых.Минимальный порог гарантирует, что области интереса (ROI) имеют достаточное количество подсчетов для правильной подгонки данных. Максимальный порог исключает мертвые клетки, потому что конденсированные клетки могут иметь гораздо большее количество (из-за конденсации и повышенной автофлуоресценции), чем в среднем в стабильной клеточной линии. Чтобы продемонстрировать морфологию проанализированных клеток, мы добавили изображения к рисунку 1 и дополнения рисунков к рисунку 2. Чтобы убедиться, что мы использовали соответствующие пороговые значения, мы проверили данные вручную.Теперь мы предоставили некоторые образцы данных того типа, который мы использовали, чтобы убедиться, что мы правильно установили пороговые значения (описано в параграфе 4 подраздела «Влияние мутаций последовательности Bh4 и низкомолекулярных ингибиторов на взаимодействия между антиапоптотическими белками и Bh4. только проапоптотические белки », данные показаны на новом рисунке 2 — рисунок в приложении 3). Эти изображения имеют пронумерованные области интереса и соответствующую таблицу измерений продолжительности жизни, чтобы продемонстрировать, что мы получаем тот же диапазон значений в ячейках с относительно нормальной и умирающей морфологией.Надеюсь, вместе с расширенным объяснением в разделе о методах это ответит на вопрос к удовлетворению рецензента. Мы ценим возможность предоставить такую ​​информацию о нашем методе, которую нам, как правило, очень сложно опубликовать. Это реальное преимущество для eLife как журнала.

5) Рисунок 2: для конструкций, изображенных в части A, является ли CTS для плохого и плохого BIM собственным BAD CTS или BIM CTS? Предположительно это первое, но из-за схожей окраски его можно ошибочно принять за второе.

Приносим извинения за недоразумение. Предположение рецензента верно. Мы изменили окраску на рисунке (теперь Рисунок 4), чтобы было более ясно, каков состав различных мутантов.

Для этого рисунка данные для всех конструкций, изображенных в A, должны быть нанесены на график в частях B и C, чтобы обеспечить возможность тщательного сравнения (т.е. добавить обратно BimEL, BimEL-d20, Bad, Bad-Bim).

Это было предметом обсуждения среди авторов оригинальной рукописи.Мы согласны с тем, что данные легче интерпретировать, если они расположены на одной оси, и что графический дисплей легче интерпретировать, чем таблицу всех данных. Поэтому мы изменили рисунок (теперь рисунок 4) в соответствии с запросом. Однако, чтобы убедиться, что мы не исказили это как новые данные, мы добавили пояснительную записку к подписи к рисунку.

Почему замена последовательности BAD Bh4 на последовательность BIM Bh4 восстанавливает привязку vBad-Bim / Bcl-XL к уровням BimEL? Это говорит о том, что BIM CTS не нужен для полного спасения.

Непонятно, почему замена BAD Bh4 на BIM Bh4 генерирует мутант, сопротивляющийся смещению. Подобно Bim, как BAD, так и PUMA имеют необычные мембранные связывающие домены на С-конце, поэтому возможно, что BAD CTS каким-то образом способствует взаимодействию. Мы планируем изучить это более подробно в будущем. Это предполагает, что действительно может существовать более одной последовательности, которая может увеличивать связывание с Bcl-XL. Однако BAD Bh4 не связывается с Bcl-XL достаточно сильно, чтобы BAD CTS придавал устойчивость к миметикам Bh4.Следовательно, сопротивление требует BIM Bh4 и BAD CTS. Это будет интересная область для будущих исследований. Мы рассмотрели это наблюдение в подразделе «Множественные остатки в Bim Bh4 способствуют устойчивости к ABT-263».

Значение R% для vBad-Bim / Bcl-XL имеет большую полосу ошибок, из-за чего неясно, полностью ли конструкция vBimEL-Bad-dCTS аннулирует взаимодействие Bcl-XL после обработки ABT-263 (как предлагается) или нет; это важное экспериментальное условие, поэтому результат для этого условия следует повторить / уточнить.

Полностью согласны с рецензентом. Большая шкала ошибок была связана с относительно небольшим количеством трансфицированных клеток, которые были проанализированы из-за низкой эффективности трансфекции с помощью этой плазмиды. Эксперимент повторяли, трансфекции были более успешными, а количество полученных изображений увеличивалось, что значительно увеличивало количество клеток, которые можно было проанализировать. В результате шкала ошибок теперь намного меньше (теперь на Рисунке 4).

6) Рисунок 4: в отношении диссоциации мембранного нацеливания vs.Функциональность связывания Bcl-XL в BIM-CTS, авторы указывают, что на фиг. 4C «митохондриальная локализация всех мутантов была одинаково плохой» и заключают, что различия, наблюдаемые в R%, не связаны со связыванием с мембраной. Однако данные в 4C могут быть одинаково интерпретированы (на основе только осмотра) как показывающие разумную тенденцию между локализацией митохондрий и влиянием на R%, особенно потому, что диапазон данных относительно узок (40-70%). Интерпретация авторов требует дальнейшего статистического рассмотрения.

Степень, в которой связывание с мембраной способствует увеличению сродства, — интересный вопрос, над которым мы много думали и пытались решить экспериментально. В исходной рукописи значения корреляции Пирсона были измерены для нескольких ячеек с использованием вручную определенных областей интереса. В попытке сделать данные менее субъективными и уменьшить размер полос погрешностей были получены новые изображения, которые использовались для автоматической оценки R Пирсона (теперь на Рисунке 7).Используемый алгоритм включен в CellProfiler Analyst. Все корреляции уменьшились из-за включения более крупных цитоплазматических областей, но, к нашему удивлению, полученный ответ был почти идентичным, хотя было проанализировано более чем в десять раз больше клеток. Визуальный осмотр показал нам, что мутанты аналогичным образом нарушены для нацеливания на митохондрии (митотрекер) с совместной локализацией от 0,1 до 0,3. Напротив, R% кажется более вариабельным, особенно при сравнении остатков 185, 188, 192.Однако по просьбе рецензента все данные были проанализированы в совокупности с использованием корреляции рангового порядка Спирмана, чтобы включить отношения, которые могут быть не линейными. Результатом было отсутствие корреляции между локализацией Bcl-XL и слабой корреляцией для Bcl-2. Мы подозреваем, что последнее может быть связано с тем, что Bcl-2 конститутивно связан с мембраной, в то время как Bcl-XL находится как в цитоплазме, так и на мембране. Теперь мы сообщаем эти данные и статистический анализ во втором абзаце подраздела «Bim CTS увеличил связывание Bim с Bcl-XL и Bcl-2 независимо от мембран, связывающих Bim».

Потенциальное сходство между данными в 4D в отношении водных и липосомных состояний было бы очень привлекательным (и поддерживало вывод авторов относительно BIM-CTS), хотя авторы не демонстрируют, что BimL локализуется на мембране в липосомальное состояние. Присутствие и степень добавленного BimL на липосомальной мембране должны быть задокументированы (например, вестерн-блоттинг водной фазы по сравнению с липосомальным осадком), поскольку важно определить, действительно ли две панели отражают разные условия водного BimL по сравнению слипосомальный BimL.

Мы согласны с тем, что это важный контроль для представленного эксперимента, который мы уже выполнили при настройке анализа. Мы не включили эти данные в исходную рукопись, потому что они были созданы как стандартная часть оптимизации анализа. Эксперименты, демонстрирующие эффективное связывание BimL с липосомами и различия в эффективности для мутантов, включены в новую статью (Chi et al., Представлена, копия включена для рецензентов), поскольку они дополняют таблицу констант связывания в этой статье и важны для показывая, что связывание CTS с липосомами не требует остатков, участвующих в активации Bax.То, что BimL эффективно связывается с липосомами и что мутанты также связывают липосомы, теперь упоминается в текущей статье в подписи к новому рисунку 7.

7) Мутационный анализ проводили только с белками Bh4, но не с Bcl-2 или Bcl-XL. Обычно модели связывания подтверждаются мутациями как партнеров по связыванию, так и заменами аминокислот. Это также могло бы идентифицировать сайты связывания на белках семейства Bcl-2.

Хотя мы согласны с тем, что эти данные были бы удовлетворительными, они не влияют на основное наблюдение, что отдельные остатки, которые мы идентифицируем в CTS Bim, ответственны за устойчивость к миметикам Bh4 и что механизмом является повышенная аффинность связывания с антиапоптотическими белками.

Эксперименты по мутагенезу, необходимые для поиска нового сайта связывания в Bim, заняли 3 года. Мутанты, которые не складываются должным образом, неинформативны, но их исключение требует много времени и может привести к тому, что кто-то пропустит реальный сайт связывания. Эксперименты ЯМР, проведенные нами и другими, не увенчались успехом из-за уширения пиков при добавлении пептидов Bim или Bim к Bax. Не существует кристаллических структур, которые включают мембранные связывающие домены любого из белков семейства Bcl-2. Без какого-либо руководства мутагенез Bcl-2 или Bcl-XL невозможен.В результате мы использовали перекрестные ссылки, чтобы попытаться найти сайт связывания. Этот подход дает хорошие результаты для Bax и слабые сшивки с Bcl-XL (см. Данные в новой статье, представленной Chi et al.). Однако до определения точного местоположения еще далеко. Полученные нами сшивки с Bcl-XL недостаточно эффективны для реализации в настоящее время. Таким образом, вероятно, нам придется определить местоположение на Bcl-XL с сайта, который мы в конечном итоге определим для Bax. Следовательно, идентификация сайта связывания на многодоменных антиапоптотических белках должна оставаться задачей будущего.

https://doi.org/10.7554/eLife.37689.042

Как различная политика и школьные системы влияют на включение детей сирийских беженцев в Швецию, Германию, Грецию, Ливан и Турцию | Сравнительные исследования миграции

Как видно из названия этого раздела, названия, используемые для классов, в которые помещаются дети-беженцы перед посещением обычных классов, различаются между странами, а со временем и внутри стран. Реальные педагогические практики также сильно различаются.Когда дети поступают в школу, они обычно еще не владеют национальным языком (за исключением Ливана). В трех европейских странах были приняты специальные положения об обучении новому языку в обычных классах, специальных классах или специальных школах.

В Германии дети посещают подготовительные или вводные классы в течение одного или двух лет, прежде чем их переводят в обычные классы. В зависимости от правил конкретной земли Бундесланд, города или даже школы, за этим может последовать дополнительная помощь в выборе немецкого языка в качестве второго, если их уровень владения немецким языком все еще отстает.Есть несколько подготовительных классов при гимназии , но гораздо чаще учащиеся средних школ посещают подготовительные классы в Hauptschule или Realschule , т.е. Только учащиеся с предыдущим опытом работы в средней школе и / или подтвержденным соответствующим академическим уровнем принимаются в гимназию или общеобразовательную школу.

Ситуация в Швеции варьируется в зависимости от школы.Однако общая политика в Швеции заключается в том, чтобы держать детей в международных классах или классах погружения только на очень короткий период. До 2016 года не существовало национальной политики, регулирующей местные организационные модели. Так, в некоторых муниципалитетах вновь прибывших детей помещали в отдельные классы на довольно продолжительный период времени, иногда до трех лет (Skolinspektionen, 2009). Однако в большинстве случаев студенты были либо быстро переведены, либо напрямую интегрированы в обычные классы. (Rydin et al., 2012). С января 2016 года был принят новый набор законодательных изменений, согласно которым студент считается вновь прибывшим в течение четырех лет после прибытия. Для этих студентов была создана новая организационная форма, называемая подготовительными классами (на шведском языке förberedelseklasser ). Важно отметить, что студенты больше не могут быть помещены в подготовительные классы на полный рабочий день и не более чем на два года. Это означает, что им дается определенное количество учебных часов в обычных классах. Сколько и по каким предметам не регламентируется, но учителя решают, исходя из их оценки индивидуальных потребностей и обстоятельств учащихся.Учащиеся могут быть переведены в обычные классы в любое время в течение учебного года в зависимости от их развития и потребностей. (Бунар, 2015). Размещение учеников в подготовительных классах не является обязательным, решение принимает завуч на основе первоначального картографирования и других социальных обстоятельств, что означает, что учеников также можно напрямую направить в обычные классы. Переход к обычным классам теперь обусловлен не только успехами учащихся в изучении шведского как второго языка, но и в значительной степени требованием, чтобы все учителя в обычных классах работали с педагогикой развития языка (Skolverket, 2017).Это новое законодательство, очевидно, руководствуется стремлением избежать социальной сегрегации между вновь прибывшими учениками и остальными школами, что было одним из наиболее критических моментов в предыдущей системе (Svensson, 2017).

В Греции инструменты, ранее использовавшиеся для интеграции учащихся-мигрантов в государственные школы, оказались неподходящими для большого числа детей-беженцев, прибывающих после 2015 года. В частности, не было инструментов, позволяющих определить условия, в которых эти дети прибывают в Грецию из раздираемых войной регионов и были спасены во время зачастую очень травмирующего путешествия по Эгейскому морю.В течение 2016–2017 учебного года беженцы и мигранты Сноска 8 в основном размещались в центрах размещения беженцев (ЦРБ) по всей стране. Это оказало значительное давление на школы, соседствующие с этими ЦОК, в частности, на очень большие ЦОК на 1000–3000 человек, такие как Эллиникон и Скарамангас. Чтобы ответить на этот вызов, министерство образования Греции создало центры приема для обучения беженцев (RFRE), которые должны были выполнять функции подготовительных классов в переходный период.RFRE работают в школах, прилегающих к центрам размещения беженцев. Они преподают в дополнительную дневную смену и преподают по специальной учебной программе, которая направлена ​​на (ре) интеграцию детей-беженцев в школу либо в Греции, либо — в случае переезда — в другие европейские страны. В более общем плане, RFRE стремятся предложить детям-беженцам и детям-мигрантам чувство нормальной жизни, соответствующее их возрасту, обеспечивая, среди прочего, их психологическую поддержку.

В 2016–17 учебном году в общей сложности 112 RFRE обслуживали потребности 3240 учащихся в возрасте от 6 до 15 лет, проживающих в 33 центрах размещения беженцев.В тот же период еще 1500 студентов-беженцев, живущих за пределами RAC, посетили утреннюю смену либо в общеобразовательных школах, либо в приемных классах приоритетных образовательных зон (ZEP), либо в одной из 26 межкультурных школ, действующих в Греции. Межкультурные школы и ZEP были созданы в 1990-х годах для интеграции детей-мигрантов в греческую систему образования. Приемные классы действуют в обычных школах. Учащиеся из числа языковых меньшинств проходят интенсивные языковые курсы на греческом языке отдельно от студентов-носителей языка, но в остальной части учебной программы они посещают обычные занятия.

В 2016–2017 годах Греция пыталась распределить детей беженцев и мигрантов в классы в соответствии с их возрастом и, если возможно, также и в соответствии с их родным языком. Однако ограниченные ресурсы школ и невозможность проведения оценочных тестов до начала учебного года привели к тому, что всех детей поместили в одни и те же RFRE, независимо от их уровня образования или любых других особых потребностей этих детей, в частности того факта, что многие из них мало или прервали обучение из-за войны.Учитывая, что многие беженцы, в том числе дети, получают серьезные травмы (Anagnostopoulos, Triantafyllou, Xylouris, Bakatsellos, & Giannakopoulos, 2016; Bronstein & Montgomery, 2011; Burnett & Peel, 2001; Christodoulou & Abou-Saleh, 2016; Porter & Haslam, 2005; ; Sirin & Rogers-Sirin, 2015), в идеале эти дети должны получать дополнительную поддержку в школах, что, к сожалению, не всегда имело место из-за общей нехватки ресурсов в греческой школьной системе. Footnote 9 Координатор по обучению беженцев (REC) является ключевой фигурой в RFRE.Эти ИЭК принадлежат постоянно назначаемому педагогическому персоналу Министерства образования, Footnote 10 , и, как правило, являются опытными учителями. Они были отобраны после призыва к подаче заявлений, а это означает, что они не были назначены в места размещения беженцев принудительно. Их основная задача — координировать на местном уровне программу министерства по обучению беженцев. НОЦы организуют все детали и решают проблемы, связанные с зачислением детей в выбранные школы.ИЭК координируют и контролируют обучение, проводимое НПО и другими организациями, работающими в местах размещения беженцев. Создание фигуры НОЦ было направлено на наведение мостов между школой и обществом. В этом смысле их ответственность велика, поскольку именно им родители-беженцы поручают своим детям ходить в школу; и, в большинстве случаев, они — единственные люди, представляющие школу, с которыми эти родители имеют определенные отношения. Тем не менее, ИЭК должны финансировать собственный проезд к местам размещения и обратно, что в большинстве случаев является довольно дорогостоящим.Сочетание высокой ответственности с низким вознаграждением отпугнуло многих учителей, и после первого года обучения, в 2017–2018 годах, только треть снова подала заявку на эту должность.

В Турции были созданы центры временного образования (TEC) для обучения сирийских детей как в лагерях беженцев, так и за их пределами (Human Rights Watch [HRW], 2017). Хотя эти центры начинались как частные инициативы, некоторые из них подписали протокол с правительством Турции и получают финансовую поддержку, и они бесплатны, в то время как другие остаются частными с низкими сборами, которые, тем не менее, недоступны для многих сирийцев, борющихся с экономическими трудностями.Кроме того, ТИК было недостаточно по количеству и вместимости. Из 81 муниципалитета, где были зарегистрированы беженцы, центры существовали только в 19 городах. Согласно отчету HRW (2017), в 2014–2015 учебном году было 34 центра внутри и 232 центра за пределами лагерей беженцев, работающих на уровне начальной и средней школы. В ТИК было зачислено более 170 000 учеников по сравнению с примерно 36 000 в турецких государственных школах. Однако многие ТИК закрыты, поскольку сирийские беженцы не в состоянии оплачивать курсы.Например, 19 ТИК открылись в Рейханлы в 2014 году, но к августу 2015 года осталось только три из-за отсутствия финансирования (Amos, 2015). Учебная программа центров практически идентична учебной программе сирийских школ — и ученики получают уроки на арабском языке, — которая разрабатывается в сотрудничестве между министерством образования временного правительства Сирии и министерством национального образования Турции (HRW, 2017). Летом 2016 года министерство образования Турции объявило о новой дорожной карте по интеграции сирийских детей в общую систему образования, утверждая, что полная интеграция будет достигнута в течение 4 лет.Для этого сирийские дети, поступающие в первый, пятый и девятый классы (точки перехода в системе образования), направляются непосредственно в обычные школы, а не в ТИК (Tekin & Yukseker, 2017).

В Турции консультационные пункты доступны в государственных школах, но они, похоже, не оборудованы для поддержки сирийских детей, перенесших серьезные травмы. Исследование Департамента изучения детей Стамбульского университета Билги показывает, что языковой барьер и отсутствие мотивации или квалификации и без того перегруженных студенческих консультантов являются основными причинами отсутствия поддержки (ÇOÇA, 2015).

В Ливане интеграция в ливанскую школьную систему стала возможной, когда в 2012–2013 годах агентства ООН согласились покрыть регистрацию и плату за обучение родителей. Это открыло двери для регистрации сирийских детей в обычных государственных школах. Однако в следующем году министерство применило ограничения, поскольку число сирийских беженцев выросло. В 2013–2014 годах политика перешла на открытие второй смены и предпочтение отделять ливанцев от сирийских студентов из опасения, что последнее повлияет на обучение первых.Тем не менее, многие сирийские семьи ставят под сомнение качество образования, предоставляемого в дневные смены (Shuayb et al., 2016), и рассматривают дневные смены как неформальное образование, предполагая, что курсы дневной смены не предполагают формальной сертификации и, следовательно, имеют предельная стоимость. Исследования показывают, что многие сирийские родители, которые не смогли записать своих детей на утренние смены, решили не записывать их на дневные смены из-за этой точки зрения (то же самое).

Чтобы решить эти проблемы, Центр исследований и разработок в области образования разработал Программу ускоренного обучения (ALP) для удовлетворения потребностей учащихся-беженцев посредством сокращенной программы базового образования для 1–9 классов, основанной на существующих учебных программах с определенной методологией обучения.Помимо ALP, неформальное образование (NFE) предлагает сирийским беженцам замену государственному образованию, но оно не аккредитовано и не регулируется ливанскими властями. Неформальное образование остается популярным выбором для многих родителей, поскольку оно обеспечивает более гибкую и благоприятную среду обучения (Shuayb, Makkouk, & Tuttunji, 2014). По оценкам, в декабре 2014 года 109 503 сирийских и других уязвимых ребенка были зачислены в программы НФО в Ливане. Программы NFE включали ALP, базовую грамотность и счет, психосоциальные мероприятия, развлекательные программы, общинное образование, дошкольное образование и коррекционные классы.В 2016 году MEHE сотрудничал с агентствами ООН в разработке основы для НФО с целью контроля качества и регулирования этой области.

В Ливане многие школы помещают учащихся в классы, которые не обязательно соответствуют их академическим способностям. Многие сирийские студенты, прибывающие в Ливан, как минимум пропустили один или два года обучения, а некоторые так и не были зачислены из-за войны. В результате большинство сирийских учащихся сталкиваются в школе как с академическими, так и с социальными проблемами.Например, несколько 14-летних детей сирийских беженцев заявили, что их поместили в 5-й класс, хотя последний класс, в котором они учились, был 3-м. Они продолжали изо всех сил стараться не отставать от остальных учеников своего класса, и им не предоставили никаких подготовительных занятий. курсы или дополнительное обучение. Неудивительно, что большинство учителей в Ливане сообщали о трудностях, связанных с управлением классом, дисциплиной и пунктуальностью при работе с сирийскими учащимися-беженцами.

Все пять стран установили какие-то классы приветствия, но на практике они работают по-разному.Сегрегация — одна из основных проблем с тяжелыми последствиями для детей. В Турции отделение детей-беженцев во временных центрах с учебной программой на арабском языке привело к тому, что дети не изучали турецкий язык, что сделало для них практически невозможным перевод в обычные классы. В Греции и Ливане большинство детей посещали отдельные дневные классы, что приводило к эффектам сегрегации и часто к более низкому качеству образования. Наиболее контрастным случаем по сравнению с этими тремя случаями является Швеция, где детей помещают во временные классы на самый короткий период времени с целью предотвращения сегрегации.

Индукция варианта короткого сплайсинга BIM повышает чувствительность пролиферирующих NK-клеток к выведению IL-15

Abstract

Адоптивный перенос аллогенных NK-клеток имеет большие перспективы для иммунотерапии рака. Существует множество протоколов для размножения NK-клеток in vitro, большинство из которых основано на стимуляции только цитокинами или в сочетании с питающими клетками. Хотя IL-15 необходим для гомеостаза NK-клеток in vivo, он обычно используется на супрафизиологических уровнях для индукции пролиферации NK-клеток in vitro.В результате адоптивный перенос таких зависимых от IL-15 NK-клеток связан с клеточным стрессом из-за внезапной отмены цитокинов. В этой статье мы описываем дозозависимую зависимость от ИЛ-15 во время экспансии человеческих NK-клеток in vitro, ведущую к активации каспазы-3 и глубокой гибели клеток при отмене ИЛ-15. Зависимость NK-клеток от IL-15 была тесно связана с соотношением BCL-2 / BIM, которое быстро снижалось во время отмены IL-15. Более того, мы наблюдали зависимую от пролиферации индукцию BIM short, высоко проапоптотического варианта сплайсинга BIM в IL-15-активированных NK-клетках.Эти данные проливают новый свет на молекулярные механизмы, участвующие в апоптозе NK-клеток после отмены цитокинов, и могут определять будущие стратегии прайминга NK-клеток в условиях клеточной терапии.

Введение

Естественные клетки-киллеры обычно называют врожденными лимфоцитами, которые проявляют сильный цитолитический потенциал в отсутствие предшествующей сенсибилизации (1). Однако приобретение функционального потенциала зависит от воздействия гомеостатических цитокинов, как показано на примере праймирования наивных NK-клеток посредством трансформации IL-15 дендритными клетками (2, 3).Стимуляция цитокинов быстро вызывает усиление эффекторной функции в NK-клетках (4–6), предполагая, что все NK-клетки обладают внутренней способностью достигать цитолитического фенотипа при достаточной стимуляции. Это справедливо даже на ранних стадиях дифференцировки при полном отсутствии как положительного, так и отрицательного рецепторного входа (7). Наиболее важным гомеостатическим цитокином во время развития NK-клеток и для выживания на периферии является IL-15 (8-10). IL-15 вызывает устойчивую пролиферацию NK-клеток, дифференцировку NK-клеток, активацию гранзима B и увеличивает эффекторные ответы, включая продукцию цитокинов и дегрануляцию (5, 7, 11, 12).

Многогранная роль, которую IL-15 играет в гомеостазе, активации и дифференцировке NK-клеток, была связана с индукцией различных нисходящих путей, зависящих от концентрации цитокинов (13). В то время как низкие дозы IL-15 индуцировали путь STAT5, обеспечивая развитие и выживание, высокие дозы индуцировали мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR). Активация mTOR увеличивает метаболическую активность клетки, переключаясь с окислительного фосфорилирования на гликолиз, процесс, называемый метаболическим перепрограммированием (14).Такое переключение источника энергии необходимо для поддержания эффекторного потенциала.

В клинических условиях цитокины используются для примирования NK-клеток для адоптивной клеточной терапии с целью повышения цитолитического потенциала и обеспечения достаточных количеств за счет индукции пролиферации. Во время экспансии in vitro часто используются супрафизиологические уровни различных цитокинов, включая IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 и их комбинации (15). Однако из-за серьезных побочных эффектов эти высокие дозы цитокинов нельзя назначать пациентам для дальнейшей поддержки роста in vivo (16-19).Следовательно, NK-клетки испытывают сильное снижение концентрации цитокинов при адоптивном переносе, что может серьезно повлиять на их функциональный потенциал, выживаемость и долгосрочное приживление (20). Хотя у нас в значительной степени отсутствуют иммунобиологические корреляты хороших результатов в испытаниях NK-клеток, общим знаменателем успеха, по-видимому, является сохранение и рост донорских NK-клеток in vivo (21). У пациентов с высоким риском или рефрактерным острым миелоидным лейкозом, получавших IL-2-активированные гаплоидентичные NK-клетки, персистенция и рост донорских NK-клеток были связаны с более высокими показателями полной ремиссии и увеличением выживаемости без прогрессирования (22, 23).Кроме того, у пациентов с рефрактерной неходжкинской лимфомой ответ на адоптивную терапию NK-клетками был связан с уровнями эндогенного IL-15 в день инфузии NK-клеток (19). Необходимость размножения адоптивно перенесенных NK-клеток in vivo подчеркивает важность понимания механизмов, регулирующих гомеостаз NK-клеток и их судьбу после внезапного лишения высоких концентраций цитокинов.

Недавно Mao et al. (20) сообщили, что NK-клетки, примированные коротким импульсом IL-15, лучше выживали и сохраняли цитолитическую активность при отщеплении цитокинов по сравнению с NK-клетками, примированными IL-2.Было показано, что IL-15 увеличивает выживаемость NK-клеток за счет сложного взаимодействия членов семейства BCL-2 (24). Действительно, улучшенная выживаемость в NK-клетках, примированных IL-15, по сравнению с клетками, примированными IL-2, была связана с STAT5-зависимой активацией BCL-2, тогда как устойчивая цитолитическая активность при отщеплении цитокинов была приписана усиленной передаче сигналов mTOR на IL-2. 15 грунтовка. Однако остается неясным, как длительное воздействие IL-15 и индукция пролиферации влияют на экспрессию и динамический баланс про- и антиапоптотических молекул в дискретных субпопуляциях NK-клеток.Члены семейства BCL-2 можно разделить на три группы: антиапоптотические, проапоптотические эффекторные белки и белки, содержащие только Bh4, которые вместе эффективно контролируют внутренний путь апоптоза. Члены семейства антиапоптотических BCL-2 (MCL-1, A1, BCL-XL и сам BCL-2) ингибируют апоптоз, связывая проапоптотические белки, такие как белки, содержащие только Bh4, BIM, NOXA или PUMA (25). Эти проапоптотические белки, содержащие только Bh4, могут прямо или косвенно (за счет снижения доступности антиапоптотических белков) активировать проапоптотические эффекторные белки BAX и BAK (26).Как только эти два основных участника внутреннего пути апоптоза активируются, они олигомеризуют и проницают внешнюю митохондриальную мембрану, что приводит к высвобождению цитохрома с в цитоплазму и, следовательно, к активации каспаз-исполнителей (27).

В этом исследовании мы исследовали динамическую регуляцию про- и антиапоптотических молекул во время индуцированной IL-15 пролиферации / активации и последующей отмены. Наши данные показывают дозозависимую зависимость от IL-15, которая коррелирует со степенью пролиферации, достигнутой во время фазы распространения in vitro.Эта зависимость приводила к повышенной восприимчивости к апоптозу при внезапной отмене IL-15 и коррелировала с измененной экспрессией анти- и проапоптотических членов семейства BCL-2. В частности, мы обнаружили, что высокопроапоптотический вариант сплайсинга BIM short (BIM S) накапливается в NK-клетках, подвергшихся воздействию высоких концентраций IL-15, что позволяет предположить механизм, с помощью которого эти клетки склонны к быстрому апоптозу. Эти результаты проливают новый свет на молекулярный механизм цитокиновой зависимости в человеческих NK-клетках после экспансии, вызванной IL-15.

Материалы и методы

Реагенты и клеточные линии

Abs были приобретены для CD57 FITC / PE, стрептавидина BV785, BCL-2 AF647, TIM-3 BV785 от BioLegend; для CD178 FITC от Thermo Fisher Scientific; для CD3 V500, CD14 V500, CD19 V500, анти-IgM BV650, биотина CD253, PD1 APC, MCL-1, очищенных от BD Bioscience; для CD56 ECD от Beckman Coulter; для CD57 функционального класса, очищенного от eBioscience; для BIM AF647 и BCL-XL AF647 от Cell Signaling Technologies; и для NKG2A PE-Vio770, биотина KIR2D и биотина KIR3DL1 / 2 от Miltenyi Biotec.Очищенные MCL-1 Ab метили с помощью набора для маркировки антител AF647 от Life Technologies в соответствии с инструкциями к набору. Ингибитор ABT-199, входящий в семейство BCL-2, был приобретен у Santa Cruz Biotechnology, а ингибитор MCL-1 S63845 — у Selleckchem (28). Сукцинимидиловый эфир Pacific Orange и Pacific Blue были закуплены у Thermo Fisher Scientific. Клеточную линию K562 из Американской коллекции типовых культур культивировали в среде RPMI 1640 с антибиотиками (пенициллин / стрептомицин; Sigma-Aldrich) и 10% инактивированной нагреванием FCS (Sigma-Aldrich) при 37 ° C.

Выделение и культивирование NK-клеток

Светло-коричневые покрытия от случайных здоровых доноров крови были приобретены в Банке крови больниц Университета Осло с согласия доноров. Используя центрифугирование под действием силы тяжести (Lymphoprep; Axis-Shield Diagnostics) и пробирки с зубчатым вращением (SepMate; Stemcell Technologies), PBMC выделяли и использовали для выделения NK-клеток. NK-клетки выделяли из PBMC с использованием набора для выделения NK-клеток и autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Свежевыделенные NK-клетки метили красителем CellTrace Violet или CFSE для анализа пролиферации клеток в соответствии с инструкциями набора (Molecular Probes).Меченные CTV / CFSE NK-клетки культивировали в среде RMPI 1640 (Sigma-Aldrich) с антибиотиками (пенициллин / стрептомицин; Sigma-Aldrich) и 10% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека (Trina Bioreactives) плюс 10 или 1 нг / мл. IL-15 (Miltenyi Biotec) в течение 6 дней при 37 ° C. На 2 и 4 дни среду заменяли свежей средой и IL-15. Через 6 дней клетки собирали, промывали и подсчитывали. Клетки либо использовали для анализа, либо инкубировали дополнительно до 48 ч в среде с или без предварительной дозы IL-15 при 37 ° C.

Окрашивание проточной цитометрией

Свежевыделенные или обработанные IL-15 NK-клетки окрашивали в буфере для окрашивания (PBS плюс 2% FCS плюс 2 мМ EDTA) с различными комбинациями антител и маркером мертвых клеток (LIVE / DEAD Fixable Near- Набор для окрашивания мертвых клеток IR или Aqua; Life Technologies). После этого клетки фиксировали в 2–4% параформальдегиде и либо непосредственно анализировали на проточном цитометре LSR II (Becton Dickinson), либо окрашивали на внутриклеточные белки после пермеабилизации 100% метанолом при -20 ° C.

Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo V10.0.8 (Tree Star). Стратегия стробирования проиллюстрирована на дополнительных рисунках 1A, 1B.

Окрашивание и анализ с помощью конфокальной микроскопии

NK-клетки, обработанные IL-15, прикрепляли к покровному стеклу, меченному клетками Cell-Tak и тканевым адгезивом (Corning), и фиксировали с использованием 4% параформальдегида с 0,2% сапонина (Sigma-Aldrich). Клетки окрашивали в буфере для конфокальной микроскопии (PBS плюс 2% FCS плюс 0,2% сапонина) либо анти-IL-15Rα (APC; BioLegend), либо нецелевым Ab (антимышиным IgG Alexa Fluor 647; Invitrogen).Монтажную среду ProLong Gold Antifade, содержащую ядерный краситель DAPI (Invitrogen), использовали для размещения клеток на предметных стеклах. Визуализацию проводили на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 710, а ImageJ использовали для количественной оценки интенсивности сигнала.

Штриховое кодирование и окрашивание членов семейства BCL-2

Для улучшения качества окрашивания внутриклеточных белков и уменьшения количества используемых антител NK-клетки, обработанные по-разному, были помечены после повышения проницаемости метанола с помощью уникальной комбинации разбавления двух красителей Pacific Blue и Pacific Апельсин (Life Technologies).После этого клетки собирали вместе и окрашивали на различные поверхностные маркеры и внутриклеточные белки-члены семейства BCL-2. Пример стратегии стробирования для обработанных IL-15 NK-клеток, которые были окрашены BCL-2, проиллюстрирован на дополнительном рис. 1C. Чтобы сравнить интенсивность экспрессии членов семейства BCL-2 между разными донорами NK-клеток в нескольких экспериментах, средние значения интенсивности флуоресценции были нормализованы для NK-клеток, выделенных от эталонного донора, включенного в каждый эксперимент с флуоресцентным штрих-кодированием.

Анализ пролиферации NK-клеток

Для анализа увеличения количества NK-клеток после обработки ИЛ-15 их количество измеряли в начале лечения ИЛ-15 и через 6 дней. Флуоросферы Flow-Count (Beckman Coulter) или Абсолютные счетные шарики CountBright (Thermo Fisher Scientific) использовали для расчета количества NK-клеток на микролитр, и соотношение между количеством NK-клеток на 6-й день и в начале лечения IL-15 составляло рассчитано. Анализ кратного изменения количества NK-клеток при непрерывном лечении ИЛ-15 после 6 дней или отмены ИЛ-15 проводили соответственно.

Для анализа степени пролиферации клеток во время 6-дневной обработки ИЛ-15 разведение CTV / CFSE измеряли на 6 день с помощью проточной цитометрии. После этого был рассчитан индекс репликации (кратное расширение за время культивирования пролиферирующих клеток; где i = номер поколения, а N i = количество событий в поколении i ) (29).

Анализ жизнеспособных NK-клеток после обработки ингибиторами членов семейства BCL-2 проводили путем культивирования обработанных IL-15 NK-клеток в течение дополнительных 48 часов с или без IL-15 в присутствии или в отсутствие 10 мкМ ABT-199 или 1 мкМ S63845.Жизнеспособность NK-клеток оценивали с использованием маркера мертвых клеток (LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit; Life Technologies).

Измерение активности каспазы-3

NK-клетки культивировали в течение 6 дней с 10 или 1 нг / мл IL-15 с последующим изменяющимся периодом непрерывного культивирования (до 48 часов) с предшествующим IL или без него. -15 доза. За час до окончания культивирования в культуру добавляли ингибитор каспазы-3 DEVD-FMK, конъюгированный с FITC (Caspase-3 Active FITC Staining Kit; Abcam), для маркировки клеток с активной активностью каспазы-3.Клетки собирали и окрашивали на маркер поверхности NK-клеток и анализировали проточной цитометрией.

Вестерн-блоттинг

NK-клеток собирали, дважды промывали ледяным PBS и лизировали в 50–100 мкл буфера для анализа радиоиммунопреципитации плюс ингибиторы протеазы / фосфатазы (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 минут на льду и затем хранили при -80 ° С. Лизаты белков оттаивали и концентрацию белка оценивали с использованием набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Лизаты белков готовили при 90 ° C в течение 5 минут с буфером для образцов NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific).Десять микрограммов белка загружали в 12% мини-гель NuPAGE Novex Bis-Tris (Life Technologies) и прогоняли в течение 45-60 минут при 150 В. После этого осуществляли перенос влажным блоттингом на мембрану из ПВДФ 0,2 мкм (Life Technologies) для 90 ‘при 4 ° C и 100 В. Мембрану блокировали в течение 1 часа в буфере TBST (1 × TBS плюс 0,1% Tween 20) плюс 5% BSA и инкубировали с Ab BIM (клон: C34C5, 1: 1000; Cell Сигнальные технологии) в одночасье. На следующий день мембрану промывали 3 раза буфером TBST и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителом против HRP кролика (1: 3000; Dako).Мембрану трижды промывали буфером TBST, визуализировали с помощью субстрата для вестерн-блоттинга Pierce ECL (Thermo Fisher Scientific) на аппарате ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories) и получали с помощью программного обеспечения ImageQuant. Окрашивание на актин B было выполнено соответствующим образом. Анализ проводился с использованием ImageJ (Национальные институты здравоохранения).

Инструмент Пегги Сью

Для анализа членов семейства BCL-2 в отсортированных NK-клетках капиллярный электрофорез и иммунодетекция белков были выполнены в системе Simple Western Peggy Sue с использованием набора для разделения размером 2–40 кДа.Клетки лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации плюс ингибиторы протеазы / фосфатазы (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 минут на льду и хранили при -80 ° C. Лизаты белков оттаивали и концентрацию белка оценивали с использованием набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Для каждого образца использовали лизаты белков с концентрацией 0,2 мг / мл. Первичные антитела разводили 1:50 и использовали готовые вторичные антитела от ProteinSimple. Лизаты белков и реагенты переносили пипеткой в ​​384-луночный планшет, центрифугировали при 2000 × g в течение 5 минут и помещали в машину Пегги Сью.Экспериментальная установка и анализ данных были выполнены с использованием программного обеспечения Compass (ProteinSimple).

РНК секвенирование

Свежевыделенные NK-клетки и 5-d-стимулированные IL-15 NK-клетки были разделены на три подгруппы (NKG2A + KIR — CD57 — , NKG2A — KIR CD57 + CD57 — и NKG2A — KIR + CD57 + CD38 low / NKG2C + ) с использованием FACSAria (BD Bioscience) при 4 ° C. Клетки 5-го дня дополнительно сортировали на пролиферирующие клетки (поколение 1) с использованием окрашивания CellTrace Violet.РНК выделяли, и библиотеку готовили с использованием системы подготовки библиотек Illumina NeoPrep. NextSeq (Illumina) (однократное считывание, 75 п.н.) использовали для секвенирования, а Bowtie (версия 2.0.5.0) и TopHat (версия 2.0.6) использовали для выполнения выравнивания чтения. Запонки (версия 2.1.1) использовались для оценки обилия транскриптов. Значения из отдельных подмножеств (количество фрагментов на килобаз транскрипта на миллион отображенных считываний) были объединены для глобального анализа, сравнивающего исходный уровень (день 0) с размножением (день 5).Изменение в log2 раза и скорректированное значение p использовались для визуализации на графике вулкана.

Статистический анализ

Для сравнения отдельных совпадающих групп или популяций использовался тест Вилкоксона. Знаковый ранговый критерий Уилкоксона выполнялся при вычислении статистической значимости данной медианы по отношению к гипотетическому значению. Для сравнения нескольких согласованных групп друг с другом был проведен одно- или двусторонний тест ANOVA. Значения статистической значимости следующие: * p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,001 и **** p <0,0001. Анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Результаты

Экспериментальная модель для изучения IL-15-индуцированной зависимости на субпопуляционном уровне в первичных NK-клетках

Для изучения молекулярных последствий цитокин-индуцированной зависимости и абстиненции первичные NK-клетки человека стимулировались либо высоким (10) нг / мл) или низкой дозе (1 нг / мл) ИЛ-15 в течение 6 дней in vitro. Через 6 дней количество NK-клеток значительно увеличилось в клетках, обработанных высокими дозами IL-15 (рис.1A), что отражается в более сильном разведении CTV и более высоком индексе репликации, чем у пациентов, получавших низкие дозы IL-15 (рис. 1B, 1C). Примечательно, что стимуляция IL-15 была связана с повышающей регуляцией IL-15Rα, который имеет решающее значение для эффективной передачи IL-15 (Fig. 1D-F) (30). NK-клетки можно разделить на различные подмножества на основе их экспрессии NKG2A, KIR и CD57, которые определяют уровень их дифференцировки (6). Хотя обработка обеими концентрациями IL-15 увеличивала долю NK-клеток NKG2A + и уменьшала долю более дифференцированных NK-клеток CD57 + , этот эффект был более выраженным в обработанных высокими дозами IL-15 NK-клетках. .Кроме того, лечение высокими дозами IL-15 привело к резкому увеличению фракции субпопуляции NKG2A + KIR + CD57 — (рис. 1G). Вместе эти начальные эксперименты создали платформу для изучения эффекта отмены цитокинов в дискретных подмножествах NK-клеток на основе их степени предшествующей активации.

РИСУНОК 1.

Экспериментальная модель для изучения индуцированной IL-15 зависимости на субпопуляционном уровне в первичных NK-клетках. ( A ) Кратное увеличение количества клеток свежевыделенных NK-клеток между началом (день 0) и через 6 дней лечения высокой (10 нг / мл) или низкой (1 нг / мл) дозой IL-15 ( n ≥ 6).( B ) Типичная гистограмма разведения CTV в NK-клетках, обработанных в течение 6 дней высокой или низкой дозой IL-15. ( C ) Индекс репликации (кратное увеличение делящихся клеток) рассчитывали на основании количества NK-клеток и их разведения по CTV после 6 дней обработки высокой и низкой дозой IL-15 ( n = 14). ( D — F ) Экспрессию IL-15Rα NK-клетками после 6 дней обработки высокой и низкой дозой IL-15 анализировали с помощью проточной цитометрии (D) или конфокальной микроскопии (E).Сводная информация о средней экспрессии IL-15Rα на клетку ( n = 20) (F). ( G ) Круговые диаграммы распределения различных субпопуляций NK-клеток на основе их экспрессии NKG2A, KIR и CD57 после выделения из периферической крови и через 6 дней лечения высокими и низкими дозами IL-15. Значимость рассчитывалась с использованием критерия Вилкоксона. * p <0,05, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Зависимая от пролиферации и субпопуляций чувствительность к отмене ИЛ-15

Для мониторинга эффекта отмены ИЛ-15 после размножения NK-клеток изолированные NK-клетки предварительно обрабатывали в течение 6 дней высокой или низкой дозой ИЛ-15.Затем клетки собирали и снова помещали в культуру на 48 часов либо с той же концентрацией IL-15, что и раньше, либо с полностью выведенным IL-15 (фиг. 2A). Эффект продолжающегося лечения ИЛ-15 по сравнению с отменой ИЛ-15 исследовали путем вычисления кратного изменения количества NK-клеток до и после дополнительного 48-часового инкубационного периода для каждого условия лечения. Как и ожидалось, продолжение лечения ИЛ-15 в течение 48 часов приводило к увеличению количества NK-клеток, которое было значительно выше, если клетки обрабатывались высокой дозой, по сравнению с низкой дозой, ИЛ-15.Напротив, количество NK-клеток уменьшалось дозозависимым образом через 48 часов после отмены цитокинов (фиг. 2B). Кроме того, мы наблюдали значительную корреляцию между уменьшением количества NK-клеток после отмены IL-15 и индексом репликации после первых 6 дней стимуляции IL-15 (рис. 2C). В этих условиях мы также обнаружили слабую экспрессию маркеров истощения PD1 и TIM-3, которые коррелировали с дозой IL-15 и снижались во время отмены цитокинов (дополнительные рисунки 2A, 2B).

РИСУНОК 2.

Зависимая от пролиферации и субпопуляции чувствительность к отмене ИЛ-15. ( A ) Иллюстрация экспериментальной установки для изучения эффектов стимуляции и отмены IL-15 в первичных NK-клетках. NK-клетки выделяли от здоровых доноров и культивировали с высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15 в течение 6 дней. Затем клетки собирали, промывали, подсчитывали и снова помещали в культуру с (полная линия) или без (пунктирная линия) предыдущей дозой IL-15 на дополнительные 48 часов. ( B ) NK-клетки обрабатывали в течение 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15, собирали и помещали в свежую среду с (+) или без (- ) предыдущая доза ИЛ-15 в течение 48 часов.Кратное изменение числа NK-клеток после дополнительной 48-часовой обработки (± IL-15) по сравнению с числами на 6-й день ( n = 15). Значимость рассчитывалась с использованием знакового рангового критерия Вилкоксона (только звездочки), тогда как критерий Вилкоксона (звездочки над линией) использовался для расчета значимости между образцами, предварительно обработанными высокой или низкой дозой ИЛ-15. ( C ) Корреляция между уменьшением количества NK-клеток через 48 часов после отмены IL-15 и их индексом репликации (кратное увеличение делящихся клеток) через 6 дней приема высокой (10 нг / мл) или низкой дозы ( 1 нг / мл) было рассчитано лечение ИЛ-15 ( n = 14).Корреляцию между кратным изменением количества NK-клеток и их индексом репликации рассчитывали с помощью рангового теста Спирмена. ( D ) Кратное уменьшение количества NK-клеток после 48 часов отмены IL-15 было рассчитано для четырех дискретных субпопуляций NK-клеток, которые ранее подвергались лечению высокими дозами IL-15 в течение 6 дней ( n = 14 ). Значимость кратного изменения количества NK-клеток между различными подмножествами NK-клеток рассчитывалась с использованием теста Фридмана. ** p <0,01, *** p <0.001, **** п. <0,0001.

Затем мы выяснили, влияет ли дифференцировка NK-клеток на восприимчивость к отмене IL-15. С этой целью мы проанализировали относительное изменение количества NK-клеток в четырех дискретных подмножествах NK-клеток на различных стадиях дифференцировки после цитокиновой стимуляции и отмены. В соответствии с их дифференциальным внутренним потенциалом к ​​пролиферации (6) уменьшение количества NK-клеток после цитокиновой депривации было более выражено в NKG2A + KIR + CD57 — и NKG2A + KIR — CD57 — , чем в более дифференцированных NKG2A — KIR + CD57 — / + NK-клетках (рис.2D). Таким образом, эти данные показывают зависимую от субпопуляции восприимчивость к отмене IL-15, связанную с их относительной пролиферативной способностью.

Отказ от IL-15 приводит к индукции апоптоза в быстро меняющихся клетках

Затем мы исследовали, была ли наблюдаемая потеря количества NK-клеток следствием повышенной скорости апоптоза. Мы обрабатывали NK-клетки в течение 6 дней высокой дозой IL-15 и анализировали активацию каспазы-3 во время последующего дополнительного 48-часового инкубационного периода в присутствии и в отсутствие IL-15.Индукция каспазы-3 была очевидна через 48 часов после отмены цитокинов (рис. 3А), поэтому мы решили провести все дальнейшие анализы именно в этот момент времени. В то время как вывод IL-15 из NK-клеток, предварительно обработанных 10 нг / мл IL-15, приводил к значительному увеличению активации каспазы-3 через 48 часов, в NK-клетках, предварительно обработанных 1 нг, не наблюдалось индуцированной отменой активации каспазы-3. / мл IL-15 (фиг. 3B). Стратификация активации каспазы-3 путем различения медленно (от нуля до одного клеточного деления) и быстро (два или более клеточных деления) циклических NK-клеток (рис.3C) выявила более выраженную активацию каспазы-3 в быстро меняющихся NK-клетках (рис. 3D).

РИСУНОК 3. Удаление

IL-15 приводит к индукции апоптоза в быстро меняющихся клетках. ( A ) NK-клетки предварительно обрабатывали высокой дозой IL-15 в течение 6 дней, собирали и затем культивировали до 48 часов с высокой дозой IL-15 или без нее. В указанные моменты времени NK-клетки анализировали на процент активных клеток, положительных по каспазе-3 ( n = 8). ( B ) NK-клетки обрабатывали в течение 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15, собирали и инкубировали в течение дополнительных 48 часов с (продолжение) или без ( отозван) предыдущая доза ИЛ-15.В конце 48-часовой обработки измеряли процент активных каспазо-3-положительных NK-клеток ( n = 8). ( C ) Типичная гистограмма разведения CTV в NK-клетках, обработанных в течение 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15. Ворота создавались вокруг медленно (от нуля до одного клеточного деления) и быстро меняющихся клеток (два или более клеточных деления). ( D ) NK-клетки обрабатывали в течение 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15 и инкубировали в течение дополнительных 48 часов без IL-15.Процент активных каспазо-3-положительных клеток оценивали для быстро и медленно циркулирующих NK-клеток ( n = 8). Значимость рассчитывалась с использованием критерия Вилкоксона. * p <0,05, ** p <0,01.

Дозозависимая повышающая регуляция членов семейства BCL-2 при лечении ИЛ-15

Чтобы получить объективное представление о про- и антиапоптотических сетях после стимуляции NK-клеток с помощью IL-15, мы выполнили анализ секвенирования РНК на NK-клетках на исходном уровне. и через 5 дней стимуляции ИЛ-15 (рис.4А). Наиболее заметная активация наблюдалась для BIRC5 , члена семейства ингибиторов апоптоза (IAP). Помимо своих антиапоптотических характеристик, BIRC5 в основном участвует в регуляции пролиферации клеток во время прикрепления хромосом / микротрубочек, контрольной точки сборки веретена и цитокинеза (31). Среди наиболее значимо активированных генов был BAX, ключевой член внутреннего пути апоптоза и прямая мишень BIM (27). Однако BCL2, который ингибирует путь апоптоза на уровне BAX, также был значительно активирован, потенциально уравновешивая проапоптотическую ось через BIM / BAX (рис.4А, таблица I).

РИСУНОК 4.

Дозозависимая повышающая регуляция членов семейства BCL-2 после лечения IL-15. ( A ) Анализ глобального секвенирования РНК, сравнивающий исходный уровень с пролиферирующими NK-клетками после 5 дней стимуляции IL-15. Выбранные анти- и проапоптотические гены, которые были значительно дифференциально экспрессированы (отсечение> 1,5), выделены синим или красным цветом соответственно ( n = 3). ( B — D ) NK-клетки обрабатывали в течение 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15 и кратным увеличением экспрессии различных анти- ( Были нанесены на график BCL-2, MCL-1 и BCL-XL) и проапоптотические (BIM) белки между 6-м днем ​​и началом лечения IL-15.Кратность увеличения рассчитывалась для массы NK-клеток и для делящихся NK-клеток, обработанных высокой или низкой дозой IL-15 ( n = 7). Значимость рассчитывалась с использованием критерия Вилкоксона. ( E ) NK-клетки обрабатывали в течение 6 дней высокой (слева) и низкой дозой (справа) IL-15, а затем инкубировали с IL-15 или без него в течение дополнительных 48 часов в присутствии BCL- 2 (ABT-199) или ингибитор MCL-1 (S63845). Показан процент жизнеспособных NK-клеток в конце эксперимента ( n = 6 доноров из одного репрезентативного эксперимента).Процент жизнеспособных NK-клеток во время продолжающегося лечения IL-15 (высокой или низкой дозой) был установлен на 100% в качестве контроля, и процент жизнеспособных NK-клеток для другого условия лечения был рассчитан по отношению к нему. Значимость рассчитывалась с использованием критерия Вилкоксона. * p <0,05.

Таблица I. Список дифференциально экспрессируемых генов

Фенотипическая оценка поверхностной экспрессии лигандов домена смерти FasL и TRAIL выявила небольшую дозозависимую и зависимую от пролиферации повышающую регуляцию, которая исчезла после удаления цитокинов в NK-клетках, предварительно обработанных высокими дозами IL- 15 (дополнительный рис.3A – C). В целом, экспрессия FasL и TRAIL была низкой в ​​условиях отмены цитокинов и, по-видимому, не вносила значительного вклада в фенотип.

Затем мы проанализировали экспрессию белка антиапоптотических BCL-2, MCL-1 и BCL-XL, а также проапоптотического BIM в первичных человеческих NK-клетках после 6 дней лечения IL-15. После обработки IL-15 NK-клетки активировали все три антиапоптотических белка, но также BIM (фиг. 4B). Все четыре члена семейства BCL-2 имели значительно более активную регуляцию в клетках, обработанных высокой дозой IL-15, по сравнению с низкой дозой IL-15.Интересно, что в то время как экспрессия MCL-1, BCL-XL и BIM увеличивалась с увеличением числа делений клеток, экспрессия BCL-2 была максимальной в медленно или неделящихся NK-клетках после инкубации с высокой дозой IL-15 (рис. 4C, 4D). . Затем мы инкубировали предварительно обработанные низкими и высокими дозами IL-15 NK-клетки в течение 48 часов без IL-15 в присутствии ингибитора BCL-2 (ABT-199) и высокоселективного ингибитора MCL-1 (S63845) (рис. . 4E) (28). В то время как ингибирование BCL-2 привело к сильному отрицательному влиянию на выживаемость NK-клеток после отмены 1 нг / мл IL-15, ингибирование MCL-1 имело маргинальный эффект, соответствующий низкой экспрессии MCL-1 в медленно циркулирующих NK-клетках ( Инжир.4E). Напротив, как BCL-2, так и MCL-1 оказались критическими для выживания NK-клеток после стимуляции 10 нг / мл IL-15 и последующей отмены. Эти данные указывают на решающую роль как BCL-2, так и MCL-1 в защите NK-клеток во время отмены IL-15 и предполагают, что эта защита более хрупкая в клетках, которые претерпели несколько раундов клеточного деления.

Измененное соотношение BCL-2 / BIM после отмены IL-15

Основываясь на наблюдении, что IL-15 индуцировал глубокую и дозозависимую активацию как про-, так и антиапоптотических белков, мы рассмотрели вопрос о том, является ли восприимчивость к отмене IL-15 в пролиферирующих NK-клетках было связано с избирательным снижением антиапоптотических белков.Мы обнаружили, что экспрессия всех трех антиапоптотических белков снижалась через 48 часов культивирования в отсутствие IL-15 (фиг. 5A). Эффект был более выражен в NK-клетках, предварительно обработанных высокими дозами IL-15. Интересно, что экспрессия проапоптотического BIM также снизилась через 48 часов после отмены IL-15, хотя и не так заметно, как BCL-2, что привело к изменению соотношений BCL-2 / BIM (рис. 5B). Баланс между анти- и проапоптотическими белками имеет решающее значение для индукции апоптоза (32). Мы обнаружили, что соотношение BCL-2 / BIM было значительно ниже в быстро делящихся NK-клетках после стимуляции IL-15 и еще больше снижалось после отмены IL-15, упав до уровней ниже, чем в покоящихся NK-клетках (рис.5С). Таким образом, измененный баланс между BCL-2 и BIM в высокопролиферирующих NK-клетках может способствовать гибели NK-клеток, наблюдаемой после удаления цитокинов.

РИСУНОК 5.

Измененное соотношение BCL-2 / BIM после изъятия IL-15. ( A ) NK-клетки обрабатывали в течение 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15, а затем инкубировали в течение дополнительных 48 часов без IL-15. Кратное снижение экспрессии различных анти- (BCL-2, MCL-1 и BCL-XL) и проапоптотических (BIM) белков через 48 ч по сравнению с началом отмены IL-15 было нанесено на график для NK-клеток в массе ( n = 7).Значимость рассчитывалась с использованием критерия Вилкоксона. ( B и C ) Соотношение BCL-2 / BIM было рассчитано для свежевыделенных NK-клеток (пунктирная линия) и для NK-клеток через 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой дозы (1 нг / мл). / мл) лечения ИЛ-15 или через 48 часов после отмены ИЛ-15. Результаты были нанесены на график для объемных (B) и для быстрых и медленных циклов (C) NK-клеток ( n = 7). Значимость увеличения или уменьшения отношения BCL-2 / BIM по сравнению с покоящимися NK-клетками (B и C) рассчитывалась с использованием знакового рангового критерия Вилкоксона (только звезды), тогда как различия в соотношении между NK-клетками, обработанными по-разному, рассчитывались. с помощью теста Фридмана.* p <0,05, *** p <0,001.

Обработка высокой дозой IL-15 индуцирует экспрессию варианта сплайсинга BIM S

Хотя соотношение BCL-2 / BIM в пролиферирующих NK-клетках снизилось до уровней ниже исходного уровня, эффект отмены IL-15 был довольно слабым ( Рис. 5C). Поэтому мы затем исследовали потенциальную роль различных вариантов сплайсинга BIM в повышенной восприимчивости высокоактивированных NK-клеток к апоптозу. Существует не менее 18 известных вариантов сплайсинга BIM с различным потенциалом индукции апоптоза, из которых основными являются BIM extra long, BIM long и BIM S (33).В частности, было показано, что BIM S более эффективен в индукции апоптоза (34). Обработка IL-15 приводила к увеличению всех трех вариантов сплайсинга BIM в течение 6 дней, причем BIM S демонстрировал наиболее сильную активацию, в частности, в NK-клетках, подвергшихся воздействию более высоких концентраций IL-15 (фиг. 6A, 6B). Чтобы дополнительно оценить влияние пролиферации, мы наблюдали за тремя вариантами сплайсинга в FACS-сортированных пролиферирующих и непролиферирующих NK-клетках после 4 дней стимуляции IL-15 с использованием прибора Peggy Sue для анализа белков малых объемов образцов (35).Мы обнаружили, что пролиферирующие NK-клетки имели более высокую экспрессию варианта BIM S, чем непролиферирующие NK-клетки (рис. 6C). Напротив, при стратификации по степени пролиферации для двух других вариантов BIM не наблюдалось четких различий. Подтверждая данные проточной цитометрии на фиг. 4C, мы обнаружили, что экспрессия BCL-2 была ниже в пролиферирующих, чем в непролиферирующих NK-клетках, при обработке высокими дозами IL-15 (фиг. 6C). Затем мы проследили экспрессию вариантов сплайсинга во время отмены IL-15 и обнаружили, что уровни BIM S оставались высокими в течение 24 часов, прежде чем упали до предельных уровней (рис.6D, дополнительный рис. 4). Это происходило параллельно с количеством BCL-2, которое примерно вдвое уменьшалось к 24 часам, что отражало данные проточной цитометрии на фиг. 5A. Вместе эти данные предполагают, что уникальная чувствительность пролиферирующих NK-клеток к апоптозу связана с избирательным накоплением токсичного варианта сплайсинга BIM S вместе со снижением уровней BCL-2.

РИСУНОК 6.

Обработка высокой дозой IL-15 индуцирует экспрессию варианта сплайсинга BIM S. ( A ) Репрезентативный вестерн-блот-анализ экспрессии вариантов сплайсинга BIM в свежевыделенных NK-клетках (день 0) и NK-клетках, обработанных в течение 2, 4 или 6 дней высокой (10 нг / мл) или низкой концентрацией доза (1 нг / мл) ИЛ-15.Актин использовался в качестве контроля нагрузки. ( B ) NK-клетки обрабатывали высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15 в течение 6 дней и кратным увеличением экспрессии различных вариантов сплайсинга BIM через 6 дней Оценивали лечение IL-15 по сравнению с покоящимися NK-клетками ( n = 6). Значимость между NK-клетками, обработанными высокой (10 нг / мл) или низкой дозой (1 нг / мл) IL-15 в течение 6 дней, в экспрессии различных вариантов сплайсинга BIM была рассчитана с использованием теста Вилкоксона. ( C ) NK-клетки обрабатывали высокой дозой IL-15 в течение 4 дней, FACS-сортировали на основе их разведения CFSE на пролиферирующие (по крайней мере, одно предшествующее деление клеток) или непролиферирующие (без деления клеток) NK-клетки, а затем анализировали у машины Пегги Сью.Было рассчитано кратное изменение между экспрессией вариантов сплайсинга BIM или BCL-2 в непролиферирующих и пролиферирующих NK-клетках ( n = 10). Значимость между непролиферирующими и пролиферирующими NK-клетками для их экспрессии вариантов сплайсинга BIM и BCL-2 рассчитывалась с использованием знакового рангового критерия Вилкоксона. ** p <0,01, *** p <0,001. ( D ) Репрезентативный вестерн-блоттинг-анализ экспрессии вариантов сплайсинга BIM и BCL-2 через 0, 24 и 48 часов отмены IL-15 в NK-клетках, предварительно обработанных высокой дозой (10 нг / мл) IL- 15 по 6 дн.Актин.

Обсуждение

Понимание того, как цитокиновый прайминг влияет на гомеостаз NK-клеток in vivo и in vitro, необходимо для развития иммунотерапии, основанной на NK-клетках. Перенос высокоактивированных NK-клеток, размноженных in vitro, в лимфопенического, предварительно кондиционированного хозяина представляет собой критическую фазу из-за внезапного изменения концентрации цитокинов. Степень, в которой сам перенос приводит к потере функции и гибели донорских NK-клеток, вероятно, зависит от многих факторов.Это включает продолжительность и степень предшествующей активации, комбинацию используемых цитокинов и применение / выполнение поддерживающих режимов системного лечения цитокинами у пациента. В этом исследовании мы создали надежную платформу для изучения судьбы дискретных подмножеств NK-клеток после резкого вывода IL-15, имитируя сценарий, в котором IL-15-активированные и-расширенные NK-клетки переносятся в пациента.

Во время вирусных инфекций мышиные NK-клетки подвергаются экспансии, за которой следует фаза сокращения из-за снижения уровней цитокинов, когда инфекция проходит.Члены семейства BCL-2 играют решающую роль в регулировании судьбы иммунных клеток во время этого процесса (36). Мы наблюдали дозозависимую и специфичную для субпопуляций повышающую регуляцию про- и антиапоптотических членов семейства BCL-2 во время стимуляции IL-15 с последующим понижением регуляции при отмене IL-15. Эти результаты подтверждают предыдущие сообщения о человеческих (37) и мышиных NK-клетках (24), демонстрируя, что стимуляция IL-15 активирует антиапоптотические белки, такие как BCL-2 и MCL-1, в NK-клетках. Кроме того, мы показываем, что отмена IL-15 приводит к снижению BCL-2 и MCL-1 в первичных NK-клетках человека, что до сих пор было описано только для NK-клеток мышей (24).В человеческих NK-клетках повышающая регуляция BCL-2 во время короткой стимуляции IL-15 зависела от STAT5, но не от mTOR, и была связана с улучшением выживаемости при отмене цитокинов in vitro и in vivo (20). Сообщалось, что у мышиных Т-клеток долгоживущие эффекторные CD8 + Т-клетки имели более высокие уровни антиапоптотического белка Bcl-2 по сравнению с их короткоживущими аналогами, а также более высокие уровни проапоптотического Bim (38). Повышенные уровни белка Bcl-2 позволили мышиным эффекторным CD8 + Т-клеткам переносить более высокие уровни Bim.Введение in vivo IL-7 или IL-15 мышам C57BL / 6, инфицированным вирусом лимфоцитарного хориоменингита, увеличивало уровни белка Bim в эффекторных Т-клетках CD8 + , тогда как ингибирование Bcl-2 приводило к снижению уровней Bim. Эти результаты предполагают, что экспрессия Bcl-2 и Bim скоординирована в мышиных Т-клетках и что уровни белка Bcl-2 определяют количество уровней белка Bim, которое клетка способна переносить. Было обнаружено, что стимуляция ex vivo мышиных NK-клеток с помощью IL-15 снижает экспрессию Bim за счет репрессии транскрипции и увеличения протеасомной деградации (24).После отмены IL-15 экспрессия Bim увеличивалась, что приводило к гибели клеток NK-клеток мыши. Кроме того, несколько групп продемонстрировали, что изменения в соотношении Bcl-2 / Bim могут сделать мышиные Т- и NK-клетки чувствительными к гибели клеток (24, 38, 39). В частности, исследования на мышах с условным нокаутом предполагают, что BCL-2 является неизбыточным белком выживания для NK-клеток мыши в состоянии покоя, тогда как MCL-1 является доминирующим белком выживания во время пролиферации (40). Важность динамики BCL-2 / BIM подтверждается нашими данными о первичных NK-клетках человека, поскольку мы наблюдали зависимую от пролиферации потерю BCL-2 во время отмены IL-15, что привело к низким отношениям BCL-2 / BIM и увеличению NK. смерть клетки.Хотя повышенные уровни MCL-1 и увеличенные соотношения BCL-2 / BIM, по-видимому, защищают от апоптоза во время продолжающейся пролиферации, такие сильно «зависимые» NK-клетки показывают падение соотношения BCL-2 / BIM ниже уровня покоящихся NK-клеток после IL. -15 вывод. Фармакологическое подавление ингибирования MCL-1 и BCL-2 во время стимуляции низкими и высокими дозами IL-15 выявило заметную роль BCL-2 в медленно пролиферирующих, не зависимых NK-клетках, тогда как BCL-2 и MCL-1 имели решающее значение для Выживание NK-клеток в условиях пролиферации и абстиненции.

Дополнительным фактором, способствующим чувствительности быстро пролиферирующих NK-клеток к отмене IL-15, была их дифференциальная экспрессия изоформ сплайсинга BIM во время стимуляции IL-15. Известно, что белок BIM имеет не менее 18 различных вариантов сплайсинга с разной способностью индуцировать апоптоз (33). Активность двух вариантов BIM extra long и long по индукции апоптоза регулируется посредством фосфорилирования по нескольким сайтам фосфорилирования (41). Кроме того, обе изоформы содержат домен связывания L-цепи динеина (DBD), что позволяет им секвестрироваться с помощью динеина на микротрубочках (42).В ответ на апоптотические стимулы они высвобождаются из микротрубочек и активируются. Напротив, вариант сплайсинга BIM S не контролируется ни посттранскрипционным фосфорилированием, ни связыванием с микротрубочками. Кроме того, он способен напрямую связывать BAX, что делает его наиболее мощной изоформой BIM, вызывающей апоптоз (33). В этом исследовании мы наблюдали, что стимуляция IL-15 в целом увеличивала экспрессию всех трех основных вариантов BIM, тогда как высокие дозы IL-15 предпочтительно усиливали высоко цитотоксический вариант BIM S, особенно в клетках, которые подверглись обширному клеточному делению.Одним из объяснений этого явления может быть повышенное производство активных форм кислорода (АФК) в пролиферирующих NK-клетках. Известно, что при экспансии NK-клеток мышей во время инфекции CMV мышей пролиферирующие NK-клетки накапливают повышенные уровни ROS из-за накопления деполяризованных митохондрий. Удаление поврежденных митохондрий / АФК посредством митофагии имело решающее значение для выживания NK-клеток в этой модели (43). АФК могут влиять на уровни экспрессии BCL-2 и BIM. На Т-клетках было показано, что активация in vivo стафилококковым энтеротоксином В приводит к снижению уровней Bcl-2 в стимулированных Т-клетках и, как следствие, к гибели клеток.Уровни Bcl-2 можно восстановить, блокируя продукцию ROS с помощью антиоксиданта Mn (III) тетракис (5,10,15,20-бензойная кислота) порфирина (32). Кроме того, известно, что повышенные уровни ROS способны стимулировать экспрессию BIM через путь ROS / JNK / BIM (44).

Недавнее исследование описало влияние четкого расписания доз стимуляции высокими дозами ИЛ-15 на NK-клетки. Непрерывное лечение высокими дозами ИЛ-15 в течение 9 дней было более эффективным в индукции устойчивой пролиферации NK-клеток, чем лечение ИЛ-15 в течение 9 дней с 3-дневным отсутствием ИЛ-15 (дни 4-6).Однако прерывистое лечение ИЛ-15 привело к улучшению выживаемости и функции NK-клеток по сравнению с непрерывным лечением ИЛ-15, что было связано с индукцией генов остановки клеточного цикла и уменьшением митохондриального дыхания из-за передачи сигналов mTOR (45). Интересно, что известно, что гены остановки клеточного цикла, включая GADD45 и P53, положительно регулируют экспрессию BIM, тогда как P53 отрицательно влияет на уровни экспрессии BCL-2 (46, 47). В человеческих NK-клетках передача сигналов mTOR тесно связана с пролиферацией (A.Пфефферле и К.-Ж. Мальмберг, неопубликованное наблюдение). Хроническая передача сигналов AKT, которая является нижестоящей мишенью передачи сигналов mTOR, приводит к подавлению BCL-2 в Т-клетках (48), что согласуется с наблюдением постепенного снижения BCL-2, когда клетки подвергаются клеточному делению, как отмечено в текущее исследование. Напротив, известно, что передача сигналов mTOR подавляет экспрессию BIM, поскольку ингибирование передачи сигналов mTOR повышает экспрессию BIM в различных типах клеток (49, 50). Однако делеция репрессора туберозного склероза 1 mTOR1 (Tsc1) привела к усилению передачи сигналов mTOR и пролиферации NK-клеток, связанной с повышенным апоптозом в NK-клетках Tsc1 — / — .Интересно, что в то время как уровни BCL-2 были сходными между NK-клетками дикого типа и нокаутом, экспрессия BIM была значительно увеличена в NK-клетках Tsc1 — / — (51). Последние данные согласуются с нашими наблюдениями на первичных NK-клетках человека, поскольку мы отметили устойчивое увеличение уровней BIM и, в частности, варианта сплайсинга BIM S в пролиферирующих NK-клетках. Следовательно, потенциальные различия в передаче сигналов mTOR могут объяснять повышенную чувствительность обработанных высокими дозами IL-15 NK-клеток к отмене IL-15.

Наши результаты демонстрируют важность точного баланса между проапоптотическими сигналами и сигналами выживания во время индуцированной IL-15 пролиферации и отмены. Остается неясным, как этот баланс контролируется во время пролиферации клеток, индуцированной другими цитокинами, включая IL-2 и IL-21 или их комбинации. Мао и др. (20) продемонстрировали, что примирование NK-клеток в течение 48 часов с помощью IL-15 поддерживает выживание NK-клеток и цитотоксическую активность при отщеплении цитокинов более эффективно, чем примированные IL-2 клетки.Более того, стимуляция IL-15 приводила к более высокой метаболической пригодности, чем стимуляция IL-2, что было связано с более сильной активацией mTOR при стимуляции IL-15. Следовательно, можно предположить, что кратковременная активация mTOR может иметь положительное влияние на выживаемость, функцию и метаболическую пригодность NK-клеток при отмене цитокинов, тогда как длительная передача сигналов mTOR может индуцировать накопление цитотоксических проапоптотических BIM, делая NK-клетки более восприимчивыми. к апоптотическим стимулам.

Таким образом, наши результаты показывают зависимое от подмножества и пролиферации изменение в соотношениях BCL-2 / BIM с повышенными уровнями токсичного варианта сплайсинга BIM S.Вместе эти изменения повышают чувствительность зависимых от IL-15 NK-клеток к отщеплению цитокинов, что приводит к апоптозу. Эти идеи могут проложить путь для подходов к редактированию генов, направленных на восстановление соотношений BCL-2 / BIM или вмешательство в BIM S или его нижележащие мишени до адоптивного переноса для продления in vivo персистенции расширенных продуктов NK-клеток. В качестве альтернативы можно спасти зависимый фенотип путем титрования уровня IL-15 перед инфузией in vivo конечного продукта клеточной терапии.

Раскрытие информации

K.-J.M. является консультантом и пользуется исследовательской поддержкой Fate Therapeutics. У других авторов нет финансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Йоханнесу Ландскрону и Джун Х. Миклебуст за любезную помощь в создании технологии флуоресцентного штрих-кодирования и доктору Джаю Раутала за критическое прочтение рукописи.

Сноски

  • Эта работа была поддержана грантами Шведского исследовательского совета, Шведского детского онкологического общества, Шведского онкологического общества, Фонда Тобиаса, Каролинского института, Фонда Веннера – Грена, Норвежского онкологического общества, Норвежский исследовательский совет, Региональное управление здравоохранения Юго-Восточной Норвегии и К.Центр иммунотерапии рака им. Г. Джебсена. B.J. финансировался за счет постдокторской стипендии Милдред Шил от Фонда доктора Милдред Шил по исследованиям рака Немецкой организации по оказанию помощи в борьбе с раком.

  • Онлайн-версия этой статьи содержит дополнительные материалы.

  • Сокращения, использованные в этой статье:

    BIM S
    BIM short
    mTOR
    мишень рапамицина у млекопитающих
    ROS
    tuous scle отношении
    Tsc1
  • Получено 20 августа 2018 г.
  • Принято 20 ноября 2018 г.
  • Авторские права © 2019 Американской ассоциации иммунологов, Inc.

Ansul Home

  • LVS нефторированный агент

    Максимальная производительность. Упрощенное обслуживание. Бескомпромиссная защита. Нефторированное жидкое подавляющее средство LVS меняет определение пожаротушения в транспортных средствах.

    Подробнее

  • Нефторированная пена класса B

    Нефторированная пена (NFF) Концентраты образуют противопожарную пену, эффективную для углеводородного топлива класса B.

    Подробнее

  • Удаленный мониторинг контейнеров

    Электронный манометр измеряет и сообщает давление и температуру контейнеров системы газового пожаротушения.

    Подробнее

  • Информация о COVID-19

    Johnson Controls предоставляет критически важные «основные продукты, услуги и персонал» во время продолжающейся пандемии COVID-19.

    Подробнее

  • Новая система SAPPHIRE® PLUS с 70 стержнями

    Добавление возможностей нового поколения и преимуществ к проверенной технологии систем очистки с использованием чистящих агентов.

    Подробнее

  • Дизайн кухни — это искусство

    Мы поняли, что пожаротушение стало наукой. ANSUL, лучший выбор в области решений для пожаротушения в ресторанах.

    Подробнее

  • EN Стандарт защиты кухонь

    Новый технический стандарт помогает гармонизировать законодательство во всей отрасли за счет создания согласованных классификаций опасностей, испытаний производительности и рекомендаций по обслуживанию и техническому обслуживанию.

    Подробнее

  • Факты о огнетушителях

    Тушение пожаров не самыми лучшими средствами подвергает риску ваш персонал и операции.Огнетушители ANSUL® RED LINE с картриджным приводом обеспечивают высокую скорость потока, необходимую в отраслях с высоким уровнем пожароопасности.

    Подробнее

  • Мониторы в сборе AOM-HD

    Новые сверхмощные колеблющиеся блоки с водным приводом обеспечивают исключительную долговечность при длительном, непрерывном или повторяющемся использовании в промышленных системах.

    Подробнее

  • Пожарная школа

    Базовая трехдневная программа, расположенная в кампусе площадью 350 акров в Маринетте, штат Висконсин, США, сочетает в себе занятия в классе и на местах с практическим тушением пожара.

    Подробнее

  • Обучение работе с пеной

    Программа «Проектирование и спецификация пеноматериалов» рассматривает дизайн, выбор оборудования, нанесение пенообразователя и установку фиксированных систем пены для различных опасностей.

    Подробнее

Клееный брус (lvl) — Kerto® LVL

Невероятно прочная и стабильная по форме деревянная балка

Kerto® LVL от Metsä Wood — это клееный брус, используемый во всех типах строительных проектов, от новостроек до реконструкции и ремонта.Kerto LVL невероятно прочен и стабилен по размерам. Kerto LVL обеспечивает высокую прочность за счет однородной склеенной структуры.

Kerto LVL изготавливается из лущеного шпоном хвойных пород толщиной 3 мм, склеенных между собой в сплошную слитку. Заготовка разрезается по длине и распиливается на балки, доски или панели LVL в соответствии с требованиями заказчика. Посмотреть видео
как производится Kerto LVL.

Продукция Kerto LVL имеет маркировку CE и сертифицирована Eurofins Expert Services Oy.

Пример использования Kerto® LVL (клееный брус)

  • Балки
  • Балки
  • Фермы
  • Рамы
  • Компоненты элементов крыши, пола и стен
  • Компоненты для промышленного применения, например производство дверей и окон
  • Компоненты для производства грузовых прицепов
  • Бетонная опалубка
  • Настил лесов

Дальнейшая обработка

Kerto LVL может подвергаться дальнейшей обработке множеством различных способов в зависимости от конечного использования и конкретных пожеланий заказчика.Услуга дальнейшей обработки является неотъемлемой частью обслуживания клиентов и цепочки поставок.

  • Шлифование: оптическое или калибровочное
  • Профилирование кромки балки, например, шип и канавка
  • Специальное пиление: прямая и коническая форма
  • Склеивание: повторное склеивание для увеличения толщины
  • Обработка с ЧПУ: сверление, шлифование, ослабление краев, надрез
  • Наращивание, например, коробчатые плиты
  • Защитные покрытия, например, WeatherGuard

Kerto® LVL доступен в следующих вариантах

Смотрите также

приложения для Kerto LVL.

Европейские классы прочности LVL

Продукция Kerto LVL соответствует или превышает требования к классам прочности, установленным европейскими производителями LVL
Бюллетень LVL за сентябрь 2019 года согласно следующей таблице

Тип Плотность 510 кг / м 3 Плотность 440 кг / м 3
Балки, балки, стойки, опалубка LVL 48 P ->

Kerto LVL S-образная балка

LVL 32 P ->

Kerto LVL Т-образная шпилька

Вертикальные и горизонтальные панели LVL 36 C / 32 C ->
Kerto LVL Q-панель		 LVL 25 C / 22 C ->
Kerto LVL L-панель
Промышленные панели и балки Kerto LVL Qp-beam & Kate
Kerto LVL специальные конструкции

Уважаемый господин, мне очень жаль: извинения перед бывшими учителями | Преподавание

Тим Доулинг

Средняя школа Брайена МакМахона, Норуолк, Коннектикут

Уважаемая г-жа Папастатис,
Я хотел бы извиниться за свое поведение в 10-м классе языковых искусств, пятый урок, особенно в тот день, когда я наотрез отказался предложить точку зрения об использовании символики в «Доме семи фронтонов».Должно быть, мне показалось странным то, как я просто смотрел на свои скрещенные руки, позволяя назреть неловкое молчание, особенно после того, как мой друг Пит, сидевший двумя рядами передо мной, поднял руку, чтобы предположить, что у меня может быть что-то особенное. понимание использования символики в Доме семи фронтонов.

Оглядываясь назад, я могу представить, что такой отказ от участия — одна из причин, по которой обучение молодых людей так удручает. Вы могли вполне разумно заключить, что я не выполнил назначенное чтение, но выполнил его или большую часть.Вы могли подозревать, что я участвовал в какой-то детской форме бунта, возможно, по наущению моих одноклассников. Или что я высказал собственное жалкое личное замечание — может быть, я возражал против того, как некритично употребляли термин «символизм» в 10-м классе. Вы могли бы классифицировать этот эпизод как внезапный приступ крайней неловкости, характерный для позднего полового созревания мужчин. Или хамская угрюмость застенчивого, эгоцентричного молодого человека.

Я был на самом деле невероятно высоким.Как и Пит. Сейчас я даже не могу вспомнить, что происходит в «Доме семи фронтонов», но в тот день я все равно усвоил урок.
Еще раз извините,
Тим Доулинг

Бим Адевунми

Колледж для девочек Федерального правительства, Сагаму, Нигерия

Уважаемая миссис Нвокебелу,
С чего начать? Я много думал об этом, и все свидетельства указывают на Мэлори Тауэрс, эту вопиющую пропаганду, которую мы питаем, пока мы умеем читать. Наша школа-интернат в Сагаму, Нигерия, находилась далеко от Корнуолла; там, где в Мэлори Тауэрс были каменные бассейны и конюшни для верховой езды, у нас были слоновья трава и муравьи-солдаты.Но единственное, что у нас было общего с Дарреллом, Салли и остальной частью банды, — это полуночные пиршества. И тебе, Нвонки — так мы тебя называли, понимаете — было предъявлено обвинение в организации этих тайных собраний. Это означало, что вам приходилось тащиться через кусты от вашего дома в служебных помещениях посреди ночи, вооружившись только фонариком, чтобы нюхать контрабанду — консервированные садины, лапшу индоми, кольца для варки, кремовые пирожные, — которые у нас были пробрался мимо старост и любовниц.Это означало, что вы должны были погрузить свою немалую тушу в полости крыши, в которых мы их хранили. Вы проводили проверки на месте, зная по нашим ухмылкам и шепотам, что вряд ли вы что-нибудь найдете. Разочарование, должно быть, заставило вас взобраться на стену.

Мне очень жаль. Надеюсь, твое бедро восстановилось. Я определенно чувствовал себя так, когда ты бил нас палкой.
С наилучшими пожеланиями,
Бим Адевунми

Сюзанна Мур

Школа для девочек Нортгейт, Ипсвич

Дорогая мисс Паксман,
Вы были моим любимым учителем, и вы преподавали мой любимый предмет: биологию.Я любил вскрытие. Мне нравился запах хлороформа по утрам… Нет, правда. Раньше я регулярно терял сознание на твоих уроках, нюхал его в лаборатории. Раньше тебе приходилось разбудить меня пощечиной. Но мне понравилось, что вы указали на собственном теле, где находятся ваши яичники. Под белым халатом! Ведь в половом воспитании это были только кролики и сифилис. Мне понравилось, что ты был очень страшным, и я решил, что мы должны знать. Школа могла набить себе голову.

Я был в ужасе, когда вы кричали на меня за убийство червя, хотя мы препарировали червяков.«Я должен уважать червя, потому что в конце концов он меня научит», — кричал ты. Мне понравилось, что ты знал, что я «плохой», но сказал маме, что я могу больше, чем работать в магазине. Моя мама сказала, что ты, наверное, лесбиянка. Что нормальная женщина хотела бы заниматься биологией; или «резать крыс», как она это называла?

Но, в отличие от большинства моих знакомых учителей, вы не отказались бы ответить на мои вопросы. Вместо этого вы намекнули на то, что можно узнать из упорного труда. Каким-то образом вы заставили меня понять, что взгляд внутрь вещей дает людям возможность смотреть и за их пределами.Вы олицетворяли уверенность, которую дает знание ужасного многого, но вы заставили нас увидеть, что попытки узнать что-либо займут всю оставшуюся жизнь.

Пока мы разбирали мертвых лягушек или рисовали цветы, мы хотели увидеть глупую улыбку, которая иногда нарушала ваше «научное» самообладание. Я помню это: вам приятно, что мы впервые видим вещи. Вы побудили мой разум кружиться, в то время как большую часть моего школьного опыта составляли «они», пытающиеся его закрыть.

Я понятия не имею, как вы вписались бы в изоляцию, в которую с тех пор превратилось «образование».Вы были своей собственной женщиной. Для меня это был действительно удивительный факт. Мне жаль, что я так и не стал биологом, но когда я бросил школу в 16 лет, вы просто сказали: «Вы делаете ошибку, но идите. И держите глаза открытыми. Это все, чтобы увидеть». Такова жизнь. Даже биология? И извините, мисс, насчет убийства червя. Я был просто перевозбужден.
С уважением, Сюзанна

Саймон Хаттенстон

Школа Латам-Хаус, Манчестер

Дорогой мистер Роберг,
Даже пятилетние есть чувства.То, что я сказал обедающей даме отвалить за кражу моего воздушного шара, не является причиной для того, чтобы вытащить меня перед школой за ухо и пригрозить ей «двойным наказанием». Кроме того, почему тебе пришлось вызывать Шэрон и унижать ее только за то, что она моя сестра? Она не сделала ничего плохого.
С уважением, Саймон.Откуда мне было знать, что «смазки для локтей» на самом деле не существует? Нет, я не писала, когда спрашивала, где она.
Саймон Дж. Хаттенстон

Уважаемый мистер Тодд,
Спасибо за то, что поблагодарили меня за то, что я пришел в заключение. Мне было очень трогательно, когда ты сказал, что я был первым мальчиком, который когда-либо явился, и пообещал, что никогда больше не будешь наказывать меня.
Приветствую, Саймон Хаттенстон

Дорогая миссис Милм,
Я знаю, что Стив немного скучен, но я действительно сочувствовал ему, когда ты сказал: «Стив, ты оооочень скучный», только потому, что он спросил тебя Опять-таки, действительно ли существовало время.
Любовь Саймон (Хаттенстон)

Уважаемая госпожа учительница французского,
Извините, что воткнул булавки в ваше сиденье. Должно быть, это было больно.
С уважением, Саймон Хаттенстон

Уважаемый мистер Пекстон,
Мне жаль, что вы не добавили в мой отчет: «Саймон так быстро адаптировался в школе, что быстро превратился в классного дурака». Моя мама была очень расстроена. Она заплакала и сразу легла в постель.
С любопытством, Саймон Хаттенстон

Уважаемый мистер Бутчер,
Я так отчетливо помню тот день, когда вы представились нам в тренажерном зале.«Меня зовут Мясник. Это пишется B.A.S.T.A.R.D. Понятно». PS Я подумал, что вы будете сокращены в тот день, когда запретят телесные наказания.
Ура, Саймон

Уважаемый мистер Дэвис,
Вы знаете, когда вы говорили: «Дайте мальчику печенье!» и: «Дайте девушке банан!» когда мы правильно ответили на вопросы? Почему ты этого не сделал?
С любопытством, Саймон Хаттенстон

Уважаемый мистер Гаджа,
Извините за слова: «Эй, Нобби, сюда» в классе.Это было неуважительно. Я знаю, что ваше настоящее имя Норберт, и я знаю, что, хотя я знаю, что на самом деле это Норберт, мне следует называть вас мистером Гаджа. Теперь я понимаю, что только твои лучшие друзья зовут тебя Нобби, и я не один из них.
Саймон

Eccles Sixth Form College
Уважаемый мистер учитель компьютерных наук,
Извините, что вылез из окна, когда увидел, как вы входите в класс. По крайней мере, это был первый этаж. (Выпил.) наш вчерашний разговор, я все еще не согласен с вами.То, что вы говорите «Пустошь» — оптимистичное стихотворение, не означает, что я тоже должен так думать. Я считаю, что Wasteland великолепен, но действительно удручает. Когда вы объяснили мне во второй раз и спросили, передумал ли я… ну, это было издевательством. А в третий раз было непростительно. Особенно, когда вы назвали меня «непослушным ублюдком». В любом случае, я подумал, что вам может быть интересно узнать, что я пошел прямо в голову, рассказал ему о том, что произошло, сорвал свой школьный галстук и рубашку, сказав ему, что я хочу бросить его паршивую гимназию.Как бы то ни было, я уехал … да, я знаю, что шесть недель — это не так уж и много. PS видимо выгнали.
(вверх) Ваш
Хаттенстон (как вы меня назвали)

Керсал Хай
Дорогая миссис Битти,
Я был так напуган, когда встретил вас в первый раз. Дело не только в том, что ты был действительно толстым и так громко кричал. Все в тебе было страшно. Все учителя тоже боялись тебя. Но вы были великолепны; лучший учитель в классе.То, как ты кричал на нас, если мы сделали что-то не так на чужом уроке, а потом пошел защищать нас перед учителем. То, как вы заставили нас поверить в то, что мы способны на все, если к этому приложим усилия. Я ненавидел искусство и мне было стыдно за свою неспособность нарисовать что-либо, что бы хоть что-то напоминало. Так что, конечно, я напортачил. То, как ты отвел меня в сторону и сказал, что я могу это сделать, и мне просто нужно было сосредоточиться на линиях, и если это не будет хорошим началом снова.

Вы помните, как вы заставили меня нарисовать, а затем раскрасить ту фотографию теннисиста Настасе, и сначала это было немного дерьмо, но к концу я невероятно гордился этим? Вы даже могли увидеть вены на его ногах.Вы сказали, что разум важнее материи, или что-то в этом роде — и вы были правы. Мы думали, что ты людоед, но ты оказался самым прекрасным человеком на земле.

Было время, когда я действительно хорошо справлялся со всем, кроме географии, и вы сказали: «Саймон блестяще справился в этом году, и меня разочаровала только его география, где он не работал достаточно усердно». Я сказал, что много работал, но был чепухой, и спросил, изменили ли вы мой отчет, и вы переписали его, сказав: «Саймон блестяще справился, за исключением географии, в которой он не очень силен.»Спасибо, миссис Б. Надеюсь, вы все еще преподаете там.
С любовью,
Саймон xxx

Мишель Хансон

Школа галантерейщиков Аске, Актон

Дорогая мисс Дентон,
Я хотел бы извиниться перед собой и всем своим классом за то, что был в целом ужасен и подшучивал над вами 56 лет назад на уроках математики. Потому что вы были одним из наших наименее ужасных учителей. Вы были молоды, довольно застенчивы , приятный, легко покраснел, и поэтому мы атаковали.Потому что это было легко. Мы ничего не могли поделать с действительно ужасными старыми учителями ведьм, которые превратили нашу жизнь в ад, такими как мисс Титмасс, учительница RE, которая встряхивала нас всякий раз, когда это было возможно, или мисс Эшли своими седыми колбасными кудрями и возмутительными наказаниями — латинское заключение для меня , для прыжка с трех ступенек на детскую площадку. Нет, мисс Дентон, вы были милы и добры. Так ты попал в шею.

Однажды вы только что закончили выплату гигантской суммы, на которую нам потребовалось половину урока, и которую вы записали на доске.Вы написали в ответ, а потом вас внезапно перезвонили к телефону. Один из нас, я не говорю кто, потому что мы все ее подзадоривали, стерли ответ и изменили его.

Ты вернулся. «Пожалуйста, мисс», — сказали мы. «У тебя неправильный ответ». И тебе пришлось снова пройти через всю гигантскую сумму, пока ты не получил правильный ответ, а затем кротко извинился за свою глупую ошибку. Все мы выглядели очень серьезно. Вы, наверное, никогда не догадывались, что это была неприятная шутка. Как мы смеялись, когда выходили из класса.Но почему? Вы никогда не были противны никому из нас. Итак, извините, мисс Дентон. Вы нам очень понравились.
Мишель

Дженни Колган

Академия Королевы Маргарет, Эр

Уважаемый учитель по дереву и металлу,
Мне очень жаль, что мы не обратили внимания и проигнорировали инструктаж по технике безопасности в пользу повторного использования. — разыгрывание «Молодых» прошлой ночью (эпизод с мышами).

Мне жаль, что когда вы сказали мне: «Ты хорошо разбираешься в математике, ты должен быть инженером-строителем, это становится увлекательной отраслью для женщин», — я взорвала свою челку (выросшую до пятен) и учил и не удосужился изучить это хоть немного, или сделать домашнее задание по техническому рисованию, и, как следствие, получил ужасный отчет.

Если бы дела не работали, создание дорог, мостов и аэропортов было бы гораздо более полезным и полезным, чем роль младшего администратора в государственном секторе, которая была моей единственной альтернативой. А теперь я вышла замуж за инженера, и у меня есть сын, который так выглядит, и он говорит: «Я буду инженером, как папа», и я шиплю ему «инженер-строитель». Затем я говорю ему, чтобы он поговорил с дедушкой. Потому что, как знает каждый ребенок учителя, чертовски ужасно учиться у собственного отца, как бы сильно вы его ни любили.И когда мы гуляем по улицам моего родного города, мы видим множество хорошо работающих, полезных, успешных, способных мальчиков, которые подходят и говорят: «Здравствуйте, мистер Колган» (вы их никогда не узнаете. Быть учителем на пенсии в маленьком городке немного похоже на то, чтобы быть рок-звездой на пенсии), и большое спасибо за все, что вы для них сделали, заставляет меня чувствовать себя еще более глупо, чем я, несомненно, был тогда.
С любовью, Дженнифер xxxx

Кваме Квей-Армах

Дорогой учитель,
Все сказано и сделано, у меня была отличная школьная жизнь.Однако по мере того, как я становлюсь старше, я все больше и больше думаю о том, почему мне было так трудно забыть тот случай, когда вы позвали мою мать в школу, чтобы сказать ей, что вы видели, как я держался за руки с белой девочкой, родители которой были «средними». класс «и что они будут очень расстроены этим, потому что расы действительно не должны смешиваться таким образом.

Мне было труднее забыть тот случай, когда вы позвали меня в свой офис и сказали, что из-за «структуры черного рта» я никогда не смогу нормально говорить по-английски.Но что мне труднее всего, так это то, что по прошествии всех этих лет я не простила вам эти комментарии. Мне довольно неприятно, что я этого не сделал, по правде говоря, потому что я часто проповедовал себе, что я давно научился ненавидеть преступление, но не преступника — или, что более уместно, ненавидеть грех расизма, а не грешника . Очевидно, в вашем случае это было неправдой.

Я пишу вам сейчас, чтобы извиниться за то, что я вспомнил вас только через эту узкую и горькую линзу.Что воспоминания об этих и подобных событиях затуманили многие хорошие дела, которые вы, должно быть, сделали для меня в своей школе. Многие вещи, которые, я уверен, положительно лежат в основе того, кем я являюсь сегодня. Вы наняли блестящего учителя, который оказал огромное влияние на мою жизнь! Итак, это письмо о прощении уже работает. Мы все больше, чем наши заблуждения, верно? Я постараюсь вспомнить это, когда в следующий раз подумаю о тебе и своем детстве.
С уважением (я работаю над этим),
Кваме

Хью Мьюир

Lister Comprehensive, Plaistow

Уважаемый Престон Томас,
Вы были главой младшей школы, заместитель начальника, руководитель и мой наставник по экономике, и есть несколько вещей, которые я мог бы с пользой избавиться от своей груди.Мальчик, который тайком дал слабительное в форме Refresher жадному однокласснику, который воровал у всех сладости, вызвав гигиенический кризис в гуманитарных науках? Это был я. Пустая трата пространства, чья ссора с другим учеником вылилась из класса на гравийное поле и закончилась тем, что мы гонялись друг за другом по кругу вокруг детской площадки, преследуемая учителем, который больше никогда не приходил? Ага, виноват. Я была одной из темных фигур, которые смогли вернуться в школу ранним вечером с помощью украденного отмычки.

Сейчас все это кажется довольно глупым, но я уверен, что если бы вы смогли собрать воедино различные нити и установить закономерность, вы бы справились с этим таким спокойным, авторитетным, разумным и юмористическим образом, как вы относились ко всему. Это было самое смешное. Мы вас не боялись; но в то же время мы думали, что не должны связываться с вами. Вы сказали, что мне следует выбрать экономику A-level, игнорируя мои протесты по поводу недостатков в математике. Ты был прав.

И еще случай, который я ношу с собой.Это произошло в шестом классе, когда я занял пустой класс в качестве раздевалки и был заперт в нем одноклассниками, которые, на всякий случай, украли мои шорты и брюки. Это потребовало некоторых объяснений, когда рукопашный бой привлек ваше внимание, но вы не просили объяснений. «С возрастом ты не перестаешь ошибаться», — сказал ты с кривой улыбкой. «Вы просто надеетесь заработать меньше».
Хью

Марина Левица

Грамматическая школа Уитни

Дорогая мисс Митчелл,
Я рада возможности извиниться за то, что была такой маленькой коровкой в ​​те годы, когда вы учили я немецкий, французский и русский.Хотя вы сейчас отдыхаете в огромной учительской в ​​небе, я все еще чувствую укол стыда, когда вспоминаю, как плохо я вел себя во время ваших уроков.

Я помню ваш терпеливый вздох, когда вы поймали меня на рисовании маленьких черных пятен на ногах ниже дыр в черных колготках или рисовании перламутрового оранжевого лака для ногтей под столом. Вы притворились, что не замечаете мой значок CND, запрещенный в школьных помещениях, или запах сигаретного дыма, оставшийся в туалете для девочек. Надеюсь, вы никогда не читали жестокие записки, которые мы с друзьями передавали в классе, комментируя вашу внешность и размышляя о вашей личной жизни.Мне стало стыдно, когда я узнал впоследствии, что ты потерял своего жениха во время Второй мировой войны, и вместо этого обучение нас стало твоей жизнью.

alexxlab

Related Articles

7 класс

Геометрия 7 класс погорелов учебник читать – Учебник для 7-9 классов Геометрия Погорелов 2014

Содержание Геометрия 7-9 класс ПогореловГеометрия — Учебник для 7-9 классовСмотрите также учебники, книги и учебные материалы:Геометрия. Учебник для 7-9 классов. Погорелов А.В.Тесты по геометрии, 7 класс, к учебнику Погорелова Геомегрия, 7-9, ФГОС, Фарков, 2017Геометрия. 7-9 класс. Учебник. Погорелов А.В. 2009Смотрите также учебники, книги и учебные материалы:Геометрия — Погорелов А.В — учебник для 7-11 классов общеобразовательных […]

7 класс

География земли 7 класс тетрадь для практических работ гдз супрычев фгос – ГДЗ (Решебник) по Географии для 7 класса, ответы

Содержание ГДЗ по географии за 7 класс тетрадь-практикум Е.С. ХодоваГДЗ к тетради для практических работ по географии 7 класс ВитченкоГДЗ по географии за 7 класс, решебник и ответы онлайнГДЗ решебники по географии 7 класс рабочие тетради и учебникиГДЗ по географии за 7 класс практические работы Витченко А.Н., Обух Г.Г.Рабочая тетрадь по географии 7 класс Витченко, […]

7 класс

Лабораторная работа по биологии 7 класса: Лабораторные работы по биологии 7 класс скачать

Содержание ▶▷▶▷ лучшие гдз по биологии 7 класс ГДЗГДЗ по биологии 7 класс рабочая тетрадь Преображенская▶▷▶ лабораторная работа по биологии 7 класс константинов гдз дающий нам представление о нас самих и томЛабораторная работа по биологии 7 класс.Характеристика растений разных семействЛабораторная работа «Папоротниковидные»Гдз по биологии 7 класс лабораторная работа 7 латюшин шапкин▶▷▶ гдз для лабораторных работ […]

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *